Ved hjælp af CRISPR/Cas9 gen redigering til at undersøge de muterede aktivitet af Mutant Calreticulin i cytokin afhængige hæmatopoietisk celler
Summary
Målrettet gen redigering bruger CRISPR/Cas9 har høj grad lettet forståelsen af de biologiske funktioner af gener. Her, udnytte vi CRISPR/Cas9 metoden til model calreticulin mutationer i cytokin-afhængige hæmatopoietisk celler for at studere deres mutationer aktivitet.
Abstract
Grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) er en adaptive immunitet system i prokaryoter, der har været repurposed af forskere til at generere RNA-styrede nukleaser, såsom CRISPR-forbundet (Cas) 9 for lokationsspecifikke eukaryote genom redigering. Genom engineering af Cas9 bruges effektivt, nemt og håndfast ændre endogene gener i mange biomedically relevante pattedyr cellelinjer og organismer. Her viser vi et eksempel på, hvordan du udnytter CRISPR/Cas9 metoden til at forstå den biologiske funktion af specifikke genetiske mutationer. Vi model calreticulin (CALR) mutationer i murine interleukin-3 (mIL-3) afhængig af pro-B (Ba/F3) celler ved levering af enkelt guide RNA’er (sgRNAs) rettet mod den endogene Calr locus i den specifikke region hvor indsættelse og/eller sletning (indel ) CALR mutationer opstår hos patienter med myeloproliferative neoplasmer (MPN), en type af blodkræft. SgRNAs oprette dobbeltstrenget pauser (DSBs) i målrettede region, der er repareret af ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) for at give indels i forskellige størrelser. Vi ansætter derefter standard Ba/F3 cellulær transformation analysen at forstå virkningen af fysiologiske niveau udtryk af Calr mutationer på hæmatopoietisk cellulær transformation. Denne fremgangsmåde kan anvendes til andre gener at studere deres biologiske funktion i forskellige pattedyr cellelinjer.
Introduction
CRISPR/Cas9 teknologi har for nylig revolutionerede målrettede genom-redigering i levende celler og organismer. Det er blevet et meget kraftfuldt værktøj til biomedicinsk forskning og er i øjeblikket ved at blive udnyttet som en potentiel avenue til behandling af genetiske sygdomme1. Grundlaget for alle genom redigeringsværktøjer bygger på oprettelsen af en nukleasen-induceret DNA dobbelt strandede pause (DSB) på den genomisk locus skal ændres. DSBs kan repareres af ikke-homologe ende-sammenføjning (NHEJ) eller homologi-instrueret reparation (HDR)2,3. Fordelen ved Cas9 nukleasen over andre genom engineering nukleaser, såsom zink finger nukleaser (ZFNs) og transkription aktivere-lignende effektor nukleaser (TALENs) er dens afhængighed af RNA for målretning nukleasen til en ønskede DNA sekvens, sammenlignet at de protein-DNA interaktioner findes i ZFNs og TALENs2,3.
Efter opdagelsen af CRISPR/Cas9 nukleasen pathway som en adaptive immunsystem i Prokaryote celler4,5, er meget indsats gået ind i tilpasning pathway til brug i pattedyr cellelinjer og model organismer2, 3. som et værktøj til redigering af genet, CRISPR/Cas9 pathway anvender to hovedkomponenter: Streptococcus pyogenes (Sp) afledte Cas9 nukleasen og sgRNAs rettet mod gen interesse2,3. SgRNA består af 20 nukleotider, direkte Cas9 til et bestemt websted på genom RNA-DNA basepar komplementaritet2,3. Mål-webstedet af sgRNA skal ligge ved siden af en protospacer tilstødende motiv (PAM) site i form af 5′ NGG, som er anerkendt af SpCas9 nukleasen. Med disse værktøjer, kan Cas9 rettes til enhver DNA sekvens ved at designe sgRNAs der er rettet mod det pågældende område. Derudover at Sp afledt Cas9, er der yderligere varianter for Cas9 med forskellige funktioner afhængigt af den konkrete anvendelse. For eksempel, er der Cas9 varianter med højere specificitet redigeringsværktøjer mål eller enkelt-strenget kavalergang evne til DNA nicking6,7. Derudover er katalytisk inaktive Cas9 for nylig blevet udviklet for transkriptionel regulering8. Forskere har nu brugt CRISPR/Cas9-systemet for en bred vifte af applikationer, som genet knockin og knockout at studere de biologiske funktioner af gener9, tab af funktion og gevinst af funktion bibliotek skærme10 og genetiske engineering af model organismer11.
I denne protokol kombinerer vi CRISPR/Cas9 metode med Ba/F3 cellulær transformation analysen til at forstå den biologiske funktion af CALR mutationer. BA/F3 celler er en murine IL-3 afhængige hæmatopoietisk cellelinje, der kan gengives IL-3 uafhængige ved udtryk for visse onkogener såsom BCR-ABL12. For at forstå om mutant calreticulin kan omdanne Ba/F3 celler til cytokin uafhængige vækst, vi målrettet exon 9 af den endogene Calr locus ved hjælp af CRISPR/Cas9 for at indføre indel mutationer og derefter trak IL-3 fra cellerne til at anvende en positiv udvælgelse pres, med mål at recapitulating gevinst af funktion CALR mutationer findes i MPN patienter. Protokollen omfatter design, kloning og levering af sgRNAs, udvikling af stabile Cas9 udtrykker celler og screening for CRISPR på-target gen redigering. Denne protokol kan anvendes til forskellige gener og forskellige cytokin-afhængige cellelinjer af interesse og er særligt værdifuldt i modellering og studere den biologiske funktion af gener involveret i kræft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her demonstrere vi brugen af CRISPR/Cas9 gen redigering til at studere den biologiske funktion af CALR mutationer i hæmatopoietisk celler. Succes i denne protokol er stærkt afhængig af flere faktorer. For det første er det vigtigt at vide hvilken slags mutationer kan være ansvarlig for fænotype, der ønskes. I denne protokol, udlæsningen er omdannelsen af Ba/F3 celler til mIL-3 uafhængighed og typerne af mutationer er indels i exon 9 af CALR. Men hvis den ønskede mutation er en enkelt basepar s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH (R01HL131835), en Damon Runyon kliniske investigator award og Starr kræft konsortium.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
