שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי לחקור את פעילות Oncogenic Calreticulin מוטציה בתאים Hematopoietic תלויי ציטוקין
Summary
ג’ין יישוב עריכה באמצעות CRISPR/Cas9 הנחתה במידה רבה את ההבנה של פונקציות ביולוגיות של גנים. כאן, אנו מנצלים את המתודולוגיה CRISPR/Cas9 כדי דגם calreticulin מוטציות בתאים hematopoietic תלויי-ציטוקין לשם פעילותם oncogenic למידה.
Abstract
באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) היא מערכת חסינות מסתגלת ב אאוקריוטים, כי יש כבר לשנות את ייעודו על ידי מדענים לייצר nucleases מונחה RNA, כגון CRISPR-הקשורים (Ca) 9 עבור גנום האיקריוטים בייעודי לאתר עריכה. הנדסה הגנום על ידי Cas9 משמש לשינוי ביעילות, בקלות, robustly גנים אנדוגני שורות תאים בתרבית של רלוונטיות biomedically ואורגניזמים רבים. הנה אנחנו מראים כיצד לנצל את המתודולוגיה CRISPR/Cas9 להבין את התפקוד הביולוגי של מוטציות גנטיות מסוימות. אנחנו מודל calreticulin (CALR) מוטציות בתאים מאתר אינטרלוקין-3 (mIL-3) התלויים pro-B (Ba/F3) על ידי משלוח של מדריך בודד RNAs (sgRNAs) מיקוד של לוקוס Calr אנדוגני באזור ספציפי שבו הכניסה ו/או מחיקה (ויאסין ) CALR מוטציות מתרחשות אצל חולים עם myeloproliferative neoplasms (MPN), סוג של סרטן הדם. SgRNAs ליצור מעברי חוט כפול (DSBs) באזור יישוב שבו תוקנו עד סוף שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) לתת indels בגדלים שונים. ואז נשתמש וזמינותו טרנספורמציה הסלולר Ba/F3 סטנדרטי כדי להבין את השפעת פיזיולוגיים רמת ביטוי של מוטציות Calr על טרנספורמציה הסלולר hematopoietic. גישה זו ניתן ליישם את הגנים האחרים ללמוד תפקידם הביולוגי בקווים בתרבית של תאים שונים.
Introduction
CRISPR/Cas9 טכנולוגיה יש מהפכה לאחרונה הגנום יישוב עריכה בתוך תאים חיים ואורגניזמים. זה הפך להיות כלי רב עוצמה עבור המחקר הביו-רפואי, כעת להיות מנוצל כמו שדרה פוטנציאל לטיפול של מחלות גנטיות1. הבסיס של כל הגנום כלי עריכה מסתמך על בריאת הנוצרות על-ידי נוקלאז DNA כפול נטושים הפסקה (DSB)-מיקומה גנומית כדי להיות שונה. DSBs אפשר לתקן על ידי שאינם הומולוגיים סוף-הצטרפות (NHEJ) או תיקון מכוון הומולוגיה (HDR)2,3. היתרון של נוקלאז Cas9 על פני אחרים הגנום הנדסה nucleases, כגון אבץ אצבע nucleases (ZFNs), nucleases אפקטור כמו מפעיל שעתוק (TALENs) הוא תלותה RNA הכוונת של נוקלאז לרצף DNA הרצוי, בהשוואה כדי אינטראקציות חלבון-DNA שנמצאו ZFNs ו TALENs2,3.
לאחר הגילוי של הנתיב נוקלאז CRISPR/Cas9 כמו מערכת חיסונית אדפטיבית תאים prokaryotic4,5, מאמץ הושקעה התאמת מסלול לשימוש שורות תאים בתרבית של מודל אורגניזמים2, 3. ככלי לעריכה ג’ין, מסלול CRISPR/Cas9 מנצל שני רכיבים מרכזיים: הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס (Sp) נגזר נוקלאז Cas9 ו- sgRNAs מיקוד הגן של הריבית2,3. SgRNA מורכב נוקלאוטידים 20 את Cas9 ישירות למקום ספציפי על הגנום באמצעות ה-RNA-DNA זוג בסיסים משלימים את החסר2,3. אתר היעד של sgRNA חייב לשקר סמוכים לאתר מוטיב סמוכים (פאם) protospacer בצורה של 5′ הגולה, אשר הוכר על ידי נוקלאז SpCas9. עם כלים אלה, Cas9 ויכולה להיות מכוונת לסייע כל רצף ה-DNA על-ידי עיצוב sgRNAs את המטרה האזור של ריבית. בנוסף ל Sp נגזר Cas9, יש גירסאות נוספות עבור Cas9 עם תכונות שונות בהתאם ליישום מסוים. לדוגמה, ישנן גרסאות Cas9 עם הם ברמת פירוט גבוהה לעריכה–יעד או יכולת המחשוף יחיד-גדיל DNA חותך6,7. יתר על כן, Cas9 catalytically לא פעיל לאחרונה פותחה עבור גנים ברמת השעתוק תקנה8. מדענים עכשיו להשתמש במערכת CRISPR/Cas9 עבור מגוון של יישומים, כגון גן knockin נוקאאוט ללמוד על תפקודים ביולוגיים של גנים9, אובדן-של-פונקציה ורווח-של-פונקציה ספריית מסכי10 ותעשיה הנדסה של אורגניזמים דגם11.
ב פרוטוקול זה, אנו משלבים את המתודולוגיה CRISPR/Cas9 עם וזמינותו טרנספורמציה הסלולר Ba/F3 כדי להבין את התפקוד הביולוגי של מוטציות CALR . Ba/F3 תאים הם קו מהתא hematopoietic IL-3 מאתר יכולה לבצע רינדור של IL-3 עצמאית על ביטוי של oncogenes מסוימים כגון BCR-ABL12. על מנת להבין אם המוטציה calreticulin יכול להפוך תאים Ba/F3 לצמיחה עצמאית ציטוקין, אנו ממוקד אקסון 9 של מיקומה Calr אנדוגני באמצעות CRISPR/Cas9 להציג ויאסין מוטציות, ואז נסוגו IL-3 מן התאים כדי להחיל לחץ חיובי הבחירה, עם המטרה של recapitulating רווח-של-פונקציה CALR מוטציות נמצאו בחולים MPN. הפרוטוקול כולל של עיצוב, שיבוט, משלוח של sgRNAs, התפתחותם של תאים לביטוי יציב של Cas9, הקרנה של CRISPR–יעד ג’ין עריכה. פרוטוקול זה ניתן להחיל על גנים שונים וקווים תא תלויי-ציטוקינים שונים של עניין, והוא יקר במיוחד ב דוגמנות ולימוד הפונקציה הביולוגי של גנים המעורבים ב סרטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנחנו מדגימים את השימוש CRISPR/Cas9 ג’ין עריכה כדי לחקור את תפקוד ביולוגי CALR מוטציות בתאים hematopoietic. ההצלחה של פרוטוקול זה תלויה מאוד גורמים רבים. ראשית, חשוב לדעת אילו סוגים של מוטציות עשויים להיות אחראים פנוטיפ רצויה. פרוטוקול זה, המדידה הוא הטרנספורמציה של תאים Ba/F3 לעצמאות mIL-3, סוגי מוט…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH (R01HL131835), פרס החוקר הקליני דיימון ראניון. האיחוד סרטן סטאר.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
