Usando CRISPR/Cas9 Gene edição para investigar a atividade oncogênica do mutante Calreticulin em células hematopoiéticas dependentes de Cytokine
Summary
Gene alvo edição usando CRISPR/Cas9 facilitou muito a compreensão das funções biológicas dos genes. Aqui, nós utilizamos a metodologia CRISPR/Cas9 a mutações de calreticulin modelo em células hematopoiéticas dependentes de citocina para estudar sua atividade oncogênica.
Abstract
Clusterizado regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) é um sistema de imunidade adaptativa em procariontes que tem sido reaproveitado pelos cientistas para gerar nucleases RNA-guiada, tais como CRISPR-associado (Cas) 9 para site-specific do genoma eucariótico edição. Engenharia de genoma por Cas9 é usada eficientemente, facilmente e robustamente modificar genes endógenos em muitas linhas de células de mamíferos biomedically relevantes e organismos. Aqui mostramos um exemplo de como utilizar a metodologia CRISPR/Cas9 para entender a função biológica de mutações genéticas específicas. Usamos modelos calreticulin (CALR) mutações em murino interleucina-3 (3 mIL) dependentes pro-B (Ba/F3) células pela entrega de RNAs de guia única (sgRNAs) visando o locus Calr endógeno na região específica onde inserção e/ou exclusão (indel ) CALR mutações ocorrem em pacientes com Neoplasias mieloproliferativas (MPN), um tipo de câncer de sangue. Os sgRNAs criar quebras da cadeia dupla (DSBs) na região alvo que são reparadas por fim não-homóloga ingressar (NHEJ) para dar puntuais de vários tamanhos. Então, nós empregamos o ensaio de transformação celular Ba/F3 padrão para entender o efeito da expressão de nível fisiológico de Calr mutações na transformação celular hematopoiética. Esta abordagem pode ser aplicada a outros genes para estudar sua função biológica em várias linhas de células de mamíferos.
Introduction
CRISPR/Cas9 tecnologia recentemente revolucionou o genoma alvo edição nos organismos e células vivas. Tornou-se uma ferramenta extremamente poderosa para a investigação biomédica e atualmente está sendo utilizado como uma avenida de potencial para a terapia de doenças genéticas1. A base para todas as ferramentas de edição de genoma baseia-se na criação de uma induzida por nuclease DNA encalhada interrupção dupla (DSB) no locus genômico a ser modificado. Os DSBs podem ser reparados pelo não-homóloga final-adesão (NHEJ) ou reparação de homologia-dirigido (HDR)2,3. A vantagem da nuclease Cas9 sobre outro genoma engenharia nucleases, tais como as nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e nucleases efetoras como ativador de transcrição (TALENs) é sua dependência de RNA para o direcionamento da nuclease para uma sequência de DNA desejada, em comparação para as interações proteína-ADN encontradas em ZFNs e TALENs2,3.
Após a descoberta da via de nuclease CRISPR/Cas9 como um sistema imune adaptativo em células procarióticas4,5, muito esforço tem ido para adaptar o caminho para o uso em linhas de células de mamíferos e de organismos modelo2, 3. como uma ferramenta para edição de gene, via CRISPR/Cas9 utiliza dois componentes principais: o Streptococcus pyogenes (Sp) derivado Cas9 nuclease e sgRNAs como alvo o gene de interesse,2,3. O sgRNA consiste de 20 nucleotídeos que Cas9 direto para um site específico sobre o genoma através de pares de base de RNA-DNA a complementaridade2,3. O site de destino do sgRNA devera ser adjacente a um site de motivo adjacentes (PAM) protospacer sob a forma de 5′ NGG, que é reconhecido pela nuclease SpCas9. Com estas ferramentas, Cas9 pode ser direcionado para qualquer sequência de DNA através da concepção de sgRNAs destino a região de interesse. Além da Sp derivada Cas9, existem variantes adicionais para Cas9 com características diferentes, dependendo da aplicação específica. Por exemplo, existem variantes de Cas9 com maior especificidade para edição no alvo ou capacidade de clivagem de single-strand DNA roubando6,7. Além disso, recentemente foi desenvolvido Cas9 cataliticamente inactiva por regulamento transcriptional8. Cientistas agora têm usado o sistema CRISPR/Cas9 para uma variedade de aplicações, tais como gene batendo e nocaute para estudar as funções biológicas de genes9, da função de perda e ganho-de-função biblioteca telas10 e genética Engenharia de organismos modelo11.
Neste protocolo, aliamos a metodologia CRISPR/Cas9 com o ensaio de transformação celular Ba/F3 para entender a função biológica do CALR mutações. BA/F3 células são uma linha de células hematopoiéticas dependentes murino IL-3 que pode ser processada IL-3 independente sobre expressão de determinados oncogenes, como BCR-ABL12. A fim de compreender se calreticulin mutante pode transformar células Ba/F3 para crescimento independente de citocina, nós alvo exon 9 do locus endógeno de Calr usando CRISPR/Cas9 para introduzir mutações indel e então IL-3 retirou as células para aplicar um pressão de seleção positiva, com o objetivo de recapitulando mutações de ganho-de-função CALR encontradas em pacientes do MPN. O protocolo inclui o projeto, a clonagem e a entrega de sgRNAs, o desenvolvimento de células expressando de estável Cas9 e triagem para CRISPR gene edição no alvo. Este protocolo pode ser aplicado a diferentes genes e várias linhas de célula dependente de citocinas de interesse e é especialmente valioso em modelagem e estudar a função biológica de genes envolvidos no câncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui vamos mostrar o uso de gene de CRISPR/Cas9 edição para estudar a função biológica de CALR mutações em células hematopoiéticas. O sucesso do presente protocolo é altamente dependente de múltiplos fatores. Em primeiro lugar, é importante saber quais os tipos de mutações podem ser responsáveis para o fenótipo desejado. Neste protocolo, a leitura é a transformação de células Ba/F3 para mIL-3 independência e os tipos de mutações são puntuais no exon 9 de CALR. No entanto, se a mu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH (R01HL131835), um prêmio de investigador clínico de Damon Runyon e o consórcio de câncer Starr.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
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