С помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена, редактирования для изучения онкогенных активность мутантов Calreticulin в зависимых Cytokine гемопоэтических клеток
Summary
Целевых генов редактирования с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 значительно облегчило понимание биологических функций генов. Здесь мы используем методологию ТРИФОСФАТЫ/Cas9 модель calreticulin мутации в cytokine зависимых гемопоэтических клеток с целью изучения их онкогенного действия.
Abstract
Кластерный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ)-это система адаптивного иммунитета в прокариотах, был многоцелевых учеными для создания РНК руководствуясь nucleases, таких как связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) 9 для конкретных участков генома эукариот редактирования. Геном инженерии, Cas9 используется для эффективно, легко и надежно изменения эндогенного гены во многих линий обеспечить соответствующие mammalian клетки и организмы. Здесь мы покажем пример как использовать методологию ТРИФОСФАТЫ/Cas9 чтобы понять биологические функции специфических генетических мутаций. Мы модель calreticulin (CALR) мутации мышиных интерлейкина-3 (mIL-3) зависит от pro-B клеток (Ba/F3) путем доставки одного руководство РНК (sgRNAs) ориентация эндогенный Локус Calr в конкретном регионе, где вставки или удаления (indel ) CALR мутации происходят в больных с миелопролиферативных новообразования (MPN), тип рака крови. SgRNAs создать двойной нити перерывы (DSBs) в регионе целевых, которые ремонтируются к концу номера гомологичных присоединения (NHEJ) дать indels различных размеров. Затем мы используем стандартного анализа Сотовый трансформации Ba/F3 чтобы понять эффект физиологического уровня выражения Calr перегласовок на кроветворную Сотовый трансформации. Этот подход может быть применен к другим генам для изучения их биологические функции в различных линий клеток млекопитающих.
Introduction
Технология ТРИФОСФАТЫ/Cas9 недавно революцию, изменения целевых генома в живых клеток и организмов. Она стала чрезвычайно мощный инструмент для биомедицинских исследований и в настоящее время используются в качестве возможности для лечения генетических заболеваний1. Основой для всех инструментов редактирования генома опирается на создание нуклеиназы индуцированной ДНК двойной мель перерыв (DSB) в геномной локусе изменение. DSBs могут быть отремонтированы, не гомологичных конец присоединение (NHEJ) или ориентированные на гомологии ремонт (HDR)2,3. Преимущество Cas9 Нуклеаза над другими генома, инженерных nucleases, таких как цинк палец nucleases (ZFNs) и транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) является его зависимость от РНК для ориентации нуклеиназы к желаемой последовательности ДНК, по сравнению для взаимодействий протеин дна, в ZFNs и Таленс2,3.
После открытия ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Нуклеаза путь как адаптивной иммунной системы в прокариотических клеток4,5много усилий прошла в адаптации путь для использования в mammalian клетки линии и модель организмов2, 3. как инструмент для редактирования гена, путь ТРИФОСФАТЫ/Cas9 использует два основных компонента: Streptococcus pyogenes (Sp), полученных Cas9 Нуклеаза и sgRNAs ориентации гена интереса2,3. SgRNA состоит из 20 нуклеотидов, прямые Cas9 для определенного сайта на геном через РНК-ДНК пары взаимодополняемости2,3. Целевой сайт sgRNA должны лежать рядом прилегающих мотив (PAM) сайт protospacer в виде 5′ NGG, который признан SpCas9 нуклеиназы. С помощью этих инструментов Cas9 могут быть направлены в любой последовательности ДНК, разработав sgRNAs этой целевой области интереса. В дополнение к Sp производным Cas9, есть дополнительные варианты для Cas9 с различными функциями в зависимости от конкретного приложения. К примеру есть варианты Cas9 с более высокой специфичности для редактирования на цель или потенциала сингл нить расщепления ДНК, уменьшение поперечного сечения6,7. Кроме того каталитически неактивных Cas9 недавно была разработана для регуляцию8. Теперь ученые использовали ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы для различных приложений, таких как ген knockin и нокаут для изучения биологических функций и генов9, функция потерь и усиления функции библиотеки экраны10 Разработка модели организмов11.
В этом протоколе мы сочетаем методологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9 с Пробирной Сотовый трансформации Ба/F3 чтобы понять биологические функции CALR перегласовок. BA/F3 клеток являются мышиных Ил-3 зависимых гемопоэтических клеток линии, которая может быть оказана Ил-3 независимых выражение определенных онкогенов как BCR-ABL12. Для того чтобы понять ли мутантов calreticulin может превратить Ba/F3 клеток цитокина независимого роста, мы ориентированы Эксон 9 эндогенного Calr локус, используя ТРИФОСФАТЫ/Cas9 представить indel мутации и затем удалились Ил-3 от клетки, чтобы применить положительный выбор давление, с целью изложив получить из функция CALR мутации в MPN пациентов. Протокол включает в себя дизайн, клонирование и доставки sgRNAs, развитие стабильных Cas9 выражая клеток и скрининга для ТРИФОСФАТЫ на цель гена редактирования. Этот протокол может применяться для различных генов и различных цитокинов зависимых клеток линии интерес и является особенно ценным в области моделирования и изучение биологической функции генов, участвующих в рак.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы продемонстрировать использование ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования для изучения биологической функции CALR перегласовок в гемопоэтических клеток. Успех этого протокола сильно зависит от нескольких факторов. Во-первых важно знать, какие виды мутации могут быть ответствен…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH (R01HL131835), премии клинический исследователь Damon Раньон и Старр рака консорциума.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
