コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出
Summary
環境内で菌類の多様性を決定する、衛生学健康への危険を識別するために利用されている方法です。このプロトコルでは、真菌の ITS 領域の拡大そして配列の産業空気サンプルからの DNA 抽出について説明します。このアプローチは、伝統的な評価方法によって見落とされることができる多くの菌類の種組成を検出します。
Abstract
従来の文化や顕微鏡ベースのアプローチなどの労働環境における真菌エクスポー ジャーを識別する多くの種の排除で起因したいくつかの制限があります。最後の 20 年間の進歩は、真菌の危険を識別するための分子ベースのアプローチに衛生研究を主導しています。これらのメソッドは、従来の方法を使用して検出されていない持っている屋内と労働環境の内で多くの種の検出にしました。空気内真菌の多様性を決定するためのアプローチのゲノム DNA の抽出、増幅、シーケンシング、および内部の真菌の分類同定を通してサンプルこのプロトコルの詳細は転写スペーサー (ITS) 領域です。そのシーケンスの結果、検出できないか、または文化または顕微鏡を使用して種レベルに特定は難しい多くの菌種の検出。これらのメソッドは、真菌の負担の定量的な対策を提供しない、彼らはハザード同定への新しいアプローチを提供し、全体の種多様性および労働環境の中で多様性を決定するため使用することができます。
Introduction
屋内と労働環境における真菌エクスポー ジャーは、アレルギー感作喘息1などの呼吸器合併症につながります。真菌危険の識別は、リスクの評価と労働者の暴露を防止するため重要です。これらの真菌危険室内汚染、外気の侵入、または労働者が現在2区域に真菌物質の輸送が行われ環境の妨害の可能性があります。真菌の暴露を評価する方法は、実行可能な文化サンプリングだけでなく、真菌胞子の顕微鏡検査に含まれています。これらのアプローチは、いくつかの制限があるし、全体的な真菌負担3に貢献できる多くの菌種を見落とすこと。文化ベースのアプローチだけの栄養媒体で栽培することができますこれらの可能な真菌の生物を区別できます。顕微鏡を介して種レベルに真菌の胞子を識別するは、胞子のような形態の共有によって混同することができます。どちらの方法、分析し多く残り正体不明で、菌種を特定する mycologists に大きく依存します。
職業上の危険識別および暴露評価で使用される既存の方法論を改良するには、多くの研究者は分子ベースの技術になっています。屋内と労働環境の中で微生物の多様性を評価するためのシーケンス ベースのアプローチは、顕微鏡や実行可能な文化3,4 などの方法と比較して検出された菌種の広範なスペクトルを明らかにしています。 ,5。ここで紹介した方法では、労働環境の空気サンプリングと真菌の潜在的な危険を識別するためのゲノム DNA の抽出をについて説明します。有害性の特定には核リボソーム内部転写スペーサー、または、その菌の中で非常に可変、真菌種6,7を区別するために一般的に使用されている地域を配列することによって、します。 8,9。多くの種門、担子菌類に属するいくつかの種はない実行可能な文化に個人を特定できるよう、職場で見と病理組織学的に区別することは困難。これらの菌は、屋内と労働環境シーケンス真菌 ITS 領域3,4,10評価内で高い相対的な豊富に観察されています。その配列は、屋内と労働環境の内で発生した菌類の多様性に一層の知識を提供しています。
プロトコルは方法を使用して収集、抽出、およびシーケンス解析のためのバイオエアロゾルから真菌の ITS 領域を増幅する詳細を紹介します。このアプローチは、空気中の微粒子を収集するために 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーの労働安全と健康 (NIOSH) の国立研究所を利用しています。このサンプラーはバイオエアロゾルと別の吸入 (≤4 μ m 空気力学的直径) を収集するために開発された、非吸入 (> 4 μ m の空気力学的直径) 粒子は、ほとんどが屋内環境内で真菌の生物の同定は、ワーカー11によって吸入する可能性が高い。サイクロン サンプラーを含む他の空気サンプラーは吸入範囲内で粒子を収集する能力を持っている市場で利用できる (< 4 μ m)12,13をフィルターを使用しています。対照的に、NIOSH 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーは、下流のアプリケーション14すぐに処理できる使い捨て、ポリプロピレン チューブにその空気力学的直径に基づく種の真菌を分離します。
ゲノム DNA を抽出し、真菌の ITS 領域の増幅のプロセスは、このプロトコルに記載されています。抽出の方法論の提示は、多くの市販キットのターゲット哺乳類細胞、細菌、または特に酵母15菌類および細菌からの DNA の抽出のために特別開発されています。本研究で使用されるプライマーは、真菌の 1 とその 2 地域4、5の両方の全体的な取材に基づいて選択されます。これらの領域のシーケンスことができます含め、バンクの多くの ITS 配列の比較のシーケンスその 1 地域、その 2 地域、または地域の 1 とその 2 の両方。大気試料の菌類の多様性より少なく支配的な真菌門に属する他のシーケンスと同様に、シーケンスの門は、子嚢菌門と担子菌類のかなりの数を明らかに、これらのメソッドが表示されますを使用して屋内設定で収集接合菌。このアプローチを使用して識別される真菌のシーケンスの広範な多様性は栽培や顕微鏡のような伝統的なハザード識別方法を使用するキャプチャと思います。真菌の ITS 領域の塩基配列決定は、真菌の危険を識別し、屋内と職業の真菌エクスポー ジャーのよりよい理解を可能にする拡張メソッドを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
シーケンス ベースのアプローチを使用して労働環境の中で真菌多様性を決定する真菌ハザードの同定と露出の評価が上がった。このアプローチを使用して頻繁にしない文化または評価の顕微鏡ベースのメソッドを使用して検出される多くの種の追加真菌の検出のため許可しています。職業などの室内環境とその増幅とシーケンスの空気サンプルからゲノム DNA の抽出からバイオエアロゾルを?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIOSH と NIEHS (AES12007001-1-0-6) 間の省庁間の契約によって部分で支えられました。
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
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