Kollektion og udvinding af erhvervsmæssig Luftprøver til analyse af svampe DNA
Summary
Bestemmelse af svampe mangfoldigheden inden for et miljø er en metode, der udnyttes i arbejdsmedicinske undersøgelser at identificere sundhedsmæssige farer. Denne protokol beskriver DNA-ekstraktion fra erhvervsmæssig Luftprøver til forstærkning og sekventering af svampe ITS regioner. Denne metode registrerer mange svampe arter, der kan blive overset af traditionelle beregningsmetoder.
Abstract
Traditionelle metoder til at identificere svampe engagementer i faglige miljøer, såsom kultur og mikroskopi-baserede tilgange, har flere begrænsninger, der har ført til udelukkelsen af mange arter. Fremskridt inden for området i de sidste to årtier har ført arbejdsmiljø forskere at henvende sig til molekylære-baserede tilgange til at identificere svampe farer. Disse metoder har ført til påvisning af mange arter inden for indendørs og faglige miljøer, der ikke har været påvist ved hjælp af traditionelle metoder. Denne protokol detaljer en fremgangsmåde til bestemmelse af svampe mangfoldighed inden for luft prøver gennem genomisk DNA-ekstraktion, forstærkning, sekventering og taksonomisk identifikation af svampe interne transskriberet spacer (ITS) regioner. Sekventering resultaterne i afsløring af mange svampe arter, der er enten ikke fundet eller vanskeligt at identificere arter niveau ved hjælp af kultur eller mikroskopi. Mens disse metoder ikke giver kvantitative foranstaltninger af svampe byrde, de tilbyder en ny tilgang til farlighedsidentifikation og kan bruges til at bestemme samlede arter rigdom og mangfoldighed i en erhvervsmæssig miljø.
Introduction
Svampe engagementer i indendørs og faglige miljøer kan resultere i respiratoriske morbiditet, herunder allergisk sensibilisering og astma1. Identifikation af svampe farer er vigtig for vurderingen af risikoen og forebygge arbejdstagernes eksponering. Disse svampe farer kan være et resultat af indendørs forurening, udendørs luft indbrud eller miljømæssige forstyrrelser, der resulterer i transporten af svampe materialer i områder, hvor arbejdstagerne er til stede2. Metoder til at vurdere svampe eksponering har inkluderet bæredygtig kultur prøveudtagning samt mikroskopisk identifikation af svampesporer. Disse tilgange har flere begrænsninger og ofte overser mange svampe arter, der kan bidrage til den samlede svampe byrde3. Kultur-baserede tilgange kan kun skelne de levedygtige fungal organismer, der kan dyrkes på næringsstof medier. At identificere svampesporer til artsniveau via mikroskopi kan blive forvirret af sporer deling lignende morfologier. Begge metoder er stærkt afhængige af mycologists til at analysere og identificere de svampe arter, med mange resterende uidentificerede.
For at forbedre eksisterende metoder, der anvendes i arbejdsskade identifikation og eksponering vurderinger, mange forskere har henvendt sig til molekylære-baserede teknologier. Sekventering-baserede metoder til vurdering af mikrobiel diversitet inden for indendørs og faglige miljøer har afsløret et bredere spektrum af svampe arter fundet i forhold til metoder som mikroskopi og levedygtige kultur3,4 ,5. Metoden præsenteres her beskriver luft prøvetagning af faglige miljøer og udvinding af genomisk DNA til identifikation af potentielle svampe farer. Fareidentifikation opnås ved sekventering nuklear ribosomale interne transskriberede spacer eller ITS, regioner, der er meget varierende blandt svampe og har været almindeligt brugt at differentiere svampe arter6,7, 8,9. Mange arter findes i erhvervsmæssig indstillinger, såsom nogle arter tilhører phylum Basidiomycota, ikke kan identificeres i levedygtige kultur og er vanskeligt at skelne mikroskopisk. Disse svampe er blevet observeret i høj relativ overflod inden for indendørs og faglige miljøer vurderet af sekventering svampe ITS regioner3,4,10. DENS sekventering har givet større viden i mangfoldigheden af svampe fundet inden for indendørs og faglige miljøer.
Protokollen beskrevet her detaljer metoderne, der anvendes til at indsamle, uddrage og forstærke svampe ITS områder fra bioaerosols til Sekvensanalyse. Denne metode udnytter det nationale Institut for Occupational Safety and Health (NIOSH) to-trins cyklon aerosol sampler at indsamle partikler i luften. Denne sampler blev udviklet til at indsamle bioaerosols og separat respirabelt (≤4 µm aerodynamisk diameter) og ikke-respirabelt (> 4 µm aerodynamisk diameter) partikler, der giver mulighed for identifikation af fungal organismer som indendørs miljøer, der er mest tilbøjelige til at blive indåndes af en arbejdstager11. Andre luft samplere, herunder cyklon samplere, er tilgængelige på markedet, som har mulighed for at indsamle partikler inden for respirabelt rækkevidde (< 4 µm) ved hjælp af filtre12,13. Derimod adskiller NIOSH to-trins cyklon aerosol sampler svampe arter baseret på deres aerodynamisk diameter til engangstændere, polypropylen rør, der umiddelbart kan behandles for downstream programmer14.
Processer til udvinding genomisk DNA og forstærke de svampe ITS regioner er beskrevet i denne protokol. Udvinding metoder præsenteret er blevet udviklet specielt til udvinding af genomisk DNA fra svampe og bakterier, som mange kommercielle kits målrette pattedyrceller, bakterier eller specifikt gær15. Primere anvendes i denne undersøgelse er udvalgt på grundlag af deres samlede dækning af både svampe dens 1 og dens 2 regioner4,5. Sekventering af disse regioner tillader til sammenligning af mange krænges ITS-sekvenser, herunder dem, denne sekvens regionen dens 1, dens 2 region eller både dens 1 og dens 2 regioner. De svampe mangfoldighed af Luftprøver indsamlet i en indendørs indstilling ved hjælp af disse metoder er vist, afslører et betydeligt antal sekvenser placeret i phyla Sæksvampe og Basidiomycota samt andre sekvenser tilhører mindre dominerende svampe phyla, som Zygomycota. Den brede mangfoldighed af svampe sekvenser identificeret ved hjælp af denne fremgangsmåde ville ikke blive fanget ved hjælp af traditionelle fare identifikation metoder som dyrkning og mikroskopi. Sekventering af svampe ITS områder giver en forbedret metode til at identificere svampe farer og giver mulighed for en bedre forståelse af indendørs og erhvervsmæssig svampe engagementer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bestemmelse af svampe mangfoldigheden inden for en erhvervsmæssig miljø ved hjælp af sekventering-baserede tilgange har forbedret svampe farevurderingen identifikation og eksponering. Ved hjælp af denne fremgangsmåde har tilladt til påvisning af mange yderligere svampe arter, der er ofte ikke registreret bruger kultur eller mikroskopi-baserede metoder til vurdering. En metode for prøveudtagning bioaerosols fra arbejdspladsen og indendørs miljøer og udvinding af genomisk DNA fra Luftprøver for dens forstærkning…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet i en del af en tværinstitutionelle aftale mellem NIOSH og NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. . Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W., Ruzer, L. S., Harley, N. H. . Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. , (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. . Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
