एक कुशल इन विट्रो स्थानांतरण विधि द्वारा एक Transcriptionally विनियमित स्लीपिंग ब्यूटी सिस्टम एक एकीकरण दोषपूर्ण Lentiviral वेक्टर में पैक
Summary
इस प्रोटोकॉल transcriptionally विनियमित सो सौंदर्य प्रणाली द्वारा मानव जीनोम में ब्याज की एक जीन के स्थिर एकीकरण प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन । दोषपूर्ण lentiviral वैक्टर के एकीकरण की तैयारी, इन विट्रो transduction मानव कोशिकाओं की, और transduced कोशिकाओं पर आणविक परख की सूचना है ।
Abstract
सो सौंदर्य (SB) transposon जीन हस्तांतरण और कार्यात्मक जीनोमिक्स के लिए सिद्ध प्रभावकारिता के साथ एक गैर वायरल घालमेल प्रणाली है । SB transposon मशीनरी, एक transcriptionally विनियमित अतिसक्रिय transposase (SB100X) और टी 2 आधारित transposon का अनुकूलन करने के लिए कार्यरत हैं । आमतौर पर, transposase और transposon प्लाज्मिड अभिकर्मक और SB100X अभिव्यक्ति द्वारा क्षणिक प्रदान की जाती है एक गठित प्रमोटर द्वारा संचालित है । यहां, हम एक कुशल विधि का वर्णन करने के लिए मानव कोशिकाओं है कि कई भौतिक और रासायनिक अभिकर्मक तरीकों के लिए प्रतिरोधी रहे है sb घटकों उद्धार, SB100X अभिव्यक्ति नियंत्रण और छुरा एक “कट और पेस्ट के माध्यम से ब्याज (भारत सरकार) के एक जीन एकीकृत sb तंत्र. अतिसक्रिय transposase की अभिव्यक्ति कसकर Tet-ON प्रणाली द्वारा नियंत्रित किया जाता है, व्यापक रूप से १९९२ के बाद से जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल. ब्याज का जीन टी 2 transposon के उल्टे दोहराता (आईआर) द्वारा पार्श्व है । दोनों SB घटकों को एकीकरण दोषपूर्ण lentiviral वैक्टर क्षणिक HEK293T कोशिकाओं में उत्पादित में पैक कर रहे हैं । मानव कोशिकाओं, या तो सेल लाइनों या मानव ऊतक से प्राथमिक कोशिकाओं, इन विट्रो में कर रहे हैं क्षणिक transduced वायरल वैक्टर के साथ. doxycycline के अलावा संस्कृति माध्यम में (dox, टेट्रासाइक्लिन अनुरूप), एक ठीक transposase अभिव्यक्ति की ट्यूनिंग मापा जाता है और इलाज कोशिकाओं के जीनोम में ब्याज की जीन के एक लंबे समय तक चलने वाले एकीकरण में परिणाम है । इस विधि कुशल और सेल लाइन (जैसे, हेला कोशिकाओं) और प्राथमिक कोशिकाओं (जैसे, मानव प्राथमिक keratinocytes) के लिए लागू है, और इस तरह आनुवंशिक इंजीनियरिंग और चिकित्सीय जीन हस्तांतरण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।
Introduction
अतिसक्रिय SB100X टी 2 के लिए युग्मित transposase आधारित transposon पहले से ही पूर्व नैदानिक जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है1,2,3, जीनोम संशोधनों4,5, और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) reprogramming6,7। आमतौर पर, SB घटकों क्षणिक प्लाज्मिड अभिकर्मक द्वारा प्रदान की जाती है और एक मजबूत गठन प्रमोटर transposase की अभिव्यक्ति ड्राइव । हालांकि, अभिकर्मक के सुधार नए तरीकों के बावजूद, दो घटक प्रणाली के वितरण के कई अनुप्रयोगों के लिए एक चुनौती बनी हुई है । इस प्रकार, एक नए वितरण प्रोटोकॉल के विकास के हित में वृद्धि हुई है । इसके अलावा प्लाज्मिड के लिए अभिकर्मक तरीके8 और mRNA9, adenoviral के आधार पर वायरल डिलिवरी10,11, adeno-एसोसिएटेड वायरल (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 और lentiviral वैक्टर15 को पूर्व में प्रस्तावित किया जा चुका है । विशेष रूप से, पसंद की प्रणाली वायरल वेक्टर के एकीकरण के बिना SB घटकों के एक परिवर्तनीय प्रसव की गारंटी चाहिए । फिर भी, transposase के गठन की अभिव्यक्ति transposon के बेकाबू rehopping के जोखिम के कारण सुरक्षा चिंताओं को उठाती है ।
इसलिए, एक परिष्कृत Tet-ऑन प्रणाली द्वारा SB100X के transcriptional विनियमन पहली चुनौती है । एक संशोधित Tet-उत्तरदायी प्रवर्तक, मूल विकसित मिनिमल cytomegalovirus (सीएमवी) प्रमोटर Timidine कळेनासे (टी) के न्यूनतम प्रमोटर (-८१) के साथ प्रतिस्थापन द्वारा प्राप्त दाद सिंप्लेक्स वायरस के जीन-1 (एचएसवी-1)16, के ऊपर क्लोन है SB100X सीडीएनए (pTetOTKSB100X) । रूपांतरित रिवर्स-टेट्रासाइक्लिन-transactivator rtTA2एस-m217 एक अलग PGK (प्लाज्मिड-pCCLएस-m2) में क्लोन मजबूत गठित प्रवर्तक (phosphoglycerate प्रमोटर, PGKrtTA2) के नियंत्रण में व्यक्त किया है । जब संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया, dox rtTA2एसM2 मॉडुलन बांधता है और Tet प्रमोटर परिसर या, कसकर SB100X अभिव्यक्ति18के विनियमित प्रेरण में जिसके परिणामस्वरूप ।
दूसरी बड़ी चुनौती कई शारीरिक और रासायनिक विधियों द्वारा मानव प्राथमिक कोशिकाओं के अकुशल अभिकर्मक से उत्पन्ना होती है. कुशलतापूर्वक मानव अभिकर्मक के लिए प्रतिरोधी कोशिकाओं में transposase देने के लिए, SB100X और rtTA2एसM2 अभिव्यक्ति कैसेट दो एकीकरण दोषपूर्ण lentiviral वैक्टर में पैक कर रहे है (IDLVs)19: IDLVTKSB और IDLVrtTA2एस– m2. वायरल वैक्टर क्षणिक HEK293T कोशिकाओं में तीसरी पीढ़ी के वैक्टर के रूप में उत्पादित कर रहे हैं20 और Vescicular Stomatitis वायरस (VSV-g), जो संक्रमण का एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदान की ग्लाइकोप्रोटीन जी के साथ pseudotyped. वेक्टर कणों एचआईवी द्वारा ultracentrifugation और titrated द्वारा केंद्रित कर रहे है-1 ढकोसला p24 केप्चर । सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं transduce करने के लिए, वेक्टर कणों polybrene के साथ जटिल है और उपस्थिति या dox की अनुपस्थिति में लक्ष्य कोशिकाओं के साथ मशीन हैं । transduced कोशिकाओं में SB100X अभिव्यक्ति की दवा पर निर्भर सक्रियण मात्रात्मक आरटी द्वारा मापा जाता है-पीसीआर (qRT-पीसीआर)18।
एक बार Tet-विनियमित SB100X अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया जाता है, भारत सरकार के स्थानांतरण (जैसे, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP) लक्ष्य सेल जीनोम में आणविक घटनाओं स्पष्ट रूप से Bak और Mikkelsen द्वारा schematized है21। टी 2-transposon आईआरएस (IDLVT2) के बीच क्लोन भारत सरकार के लिए एक तीसरी IDLV वेक्टर एक अभिव्यक्ति कैसेट ले जा रहा है और निर्माण के रूप में ऊपर उल्लेख पैक । अन्त में, तीन IDLV वैक्टर को कुशलतापूर्वक transduce मानव कोशिकाओं (जैसे, प्राथमिक keratinocytes) इन विट्रो में इस्तेमाल किया जा सकता है और भारत सरकार को doxycycline18की उपस्थिति में एकीकृत कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का वर्णन करने के लिए छुरा सो सौंदर्य-मध्यस्थता स्थानांतरण द्वारा लक्ष्य कोशिकाओं के जीनोम में एक भारत सरकार को एकीकृत । हालांकि एसबी प्रणाली जीनोम संपादन के लि…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मोडेना-pCCLएस-M2 PGKrtTA2 के साथ हमें प्रदान करने के लिए प्रो Zappavigna, विश्वविद्यालय मोडेना और Reggio एमिलिया, प्लाज्मिड, इटली के लिए धन्यवाद । हम यह भी स्वीकार करते है प्रो जेड Ivics (पॉल Ehlrich संस्थान, Langen, जर्मनी) और प्रो जेड Izvak (मैक्स Delbruck आणविक चिकित्सा के लिए केंद्र, बर्लिन, जर्मनी) pCMVSB100X और पीटी/BH plasmids के लिए । इस काम के डेबरा अंतर्राष्ट्रीय और इतालवी विश्वविद्यालय और अनुसंधान मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine | Lonza | BE12-614F | Cell culture medium. |
| HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production. |
| Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml | Lonza | DE17-602E | Reagents for cell culture medium. |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | Reagent for cell culture medium. |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline | Lonza | BE17-737E | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% | Merck | 106580 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Sterile water for injection | Fresenius Kabi | – | Reagent for HBS 2X preparation. |
| 0.45 µm PESS filter | Whatman | 10462100 | Filters used to remove cell debris from viral supernatant. |
| Polyallomer Beckman tubes | Beckman Coulter | 326823 | Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation. |
| PBS-1X w/o Ca, Mg | Lonza | BE17-516F | Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension. |
| HIV-1 Gag p24 immunocapture kit | Perkin Elmer | NEK50001KT | Kit for IDLV particle titration. |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | Reagent to enhance transduction efficiency. |
| Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg | GIBCO | BE17-160E | Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted). |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | 100938B | AnalaR BDH | Reagent for trypsin working solution preparation. |
| 0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) | GIBCO | 15400-054 | Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted). |
| Donor Bovine Serum, New Zealand Origin | GIBCO | 16030-074 | Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer). |
| Ham’s F12 media | GIBCO | 21765 | Medium for keratinocytes. |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | Serum for HeLa cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin | GIBCO | 10099-141 | Serum for human primary keratinocyte culture medium. |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Adenine | VWR | 1152-25 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Hydrocortisone | VWR | 3867-1 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T5516 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Human EGF | Austral Biological | GF-010-9 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody | Miltenyi Biotech | 130-096-099 | To label feeder layer. |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | RNA purification kit. |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18080051 | Reverse transcriptase kit. |
| Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) | Sigma-Aldrich | D7295 | Reagent for semi-quantitative PCR. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | (any) | – | Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR. |
| GoTaq G2 Hot Start Polymerase | Promega | M740B | Taq polymerase. |
| Agarose, for molecular biology | Sigma-Aldrich | A9539 | Reagent for agarose gel electrophoresis. |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | Invitrogen | 15581028 | Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Reagent for agarose gel electrophoresis. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D-9891 | drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4304437 | TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe. |
| 15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon Corning | 352096 | Tubes for cell collection and vector dilution preparation. |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile | Falcon Corning | 353025 | Cell culture dish for viral production. |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile | Falcon Corning | 353046 | Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction. |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 | Tubes for dilution preparation. |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL | Eppendorf | 0030 120.094 | Tubes for dilution preparation. |
| 0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free | (any) | – | Tubes for semi-quantitative PCR. |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystem | 4346906 | 96-well for qRT-PCR. |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap | BD Falcon | 352052 | Tubes for flow cytometry acquisition. |
| Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) | (any) | – | Pipettes for sterile tissue culture applications. |
| Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) | (any) | – | Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications. |
| pH meter | (any) | – | Equipment for measurement of HBS 2X pH. |
| PCR Thermal cycler | (any) | – | Equipment for semi-quantitative PCR. |
| Agarose gel electrophoresis equipment | (any) | – | Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR. |
| BD FACS Canto II 2LSR 4/2 | BD | – | Flow cytometer. |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 7900HT | Equipment for qRT-PCR. |
| Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. | (any) | – | Centrifuge for cell culture processing and spinoculation. |
| Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor | Beckman Coulter | – | Ultracentrifuge for lentiviral particle production. |
| Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid). | |||
| Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction. | |||
References
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
- Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
- Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
- Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712 (2014).
- Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
- Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
- Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344 (2013).
- Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771 (2013).
- Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
- Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
- Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
- Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
- Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
- Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
- Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2012).
- Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).
