Een efficiënte In Vitro omzetting methode door een Transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty systeem verpakt in een defecte lentivirale Vector integratie

Summary

Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom door het transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty -systeem. Voorbereiding van de integratie van defecte lentivirale vectoren, de in vitro -transductie van menselijke cellen en de moleculaire test op getransduceerde cellen worden gemeld.

Abstract

De Schone slaapster (SB) transposon is een niet-virale integratie systeem met bewezen werkzaamheid voor genenoverdracht en functionele genomica. Voor het optimaliseren van de SB transposon machine, zijn een transcriptionally gereglementeerde hyperactief transposase (SB100X) en T2 gebaseerde transposon tewerkgesteld. Typisch, de transposase en de transposon Transient worden geleverd door plasmide transfectie en SB100X expressie wordt aangestuurd door een constitutief promotor. Hier beschrijven we een efficiënte methode om te leveren van de SB-componenten aan menselijke cellen die resistent zijn tegen verschillende transfectie van fysische en chemische methoden, om te controleren SB100X expressie en stabiel integreren een gen van belang (Indiase) door middel van een “cut and paste” SB mechanisme. De expressie van hyperactieve transposase is streng gecontroleerd door het Tet-ON systeem, op grote schaal gebruikt om te bepalen van genexpressie sinds 1992. Het gen van belang wordt geflankeerd door omgekeerde herhalingen (IR) van de T2 transposon. Beide componenten SB zijn verpakt in integratie defecte lentivirale vectoren Transient geproduceerd in HEK293T cellen. Menselijke cellen, cellijnen of primaire cellen van menselijk weefsel, zijn in vitro Transient getransduceerde met virale vectoren. Bij toevoeging van doxycycline (dox, tetracycline analoge) in het kweekmedium, een fijnafstemming van transposase expressie wordt gemeten en leidt tot een duurzame integratie van het gen van belang in het genoom van de behandelde cellen. Deze methode is efficiënt en die gelden voor de cellijn (bijvoorbeeld HeLa cellen) en primaire cellen (bijvoorbeeld menselijke primaire keratinocyten), en vormt aldus een waardevol instrument voor genetische manipulatie en therapeutische genenoverdracht.

Introduction

Het hyperactieve SB100X transposase gekoppeld aan de T2 gebaseerde transposon is reeds gebruikt in preklinische gene therapie toepassingen^1,2,3, genoom wijzigingen^4,5, en Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)^6,7te herprogrammeren. Typisch, de SB-componenten worden Transient verstrekt door plasmide transfectie en een sterke constitutieve promotor rijdt de uitdrukking van de transposase. Echter, ondanks de verbeterde nieuwe methoden van transfectie, levering van de tweecomponenten systeem blijft een uitdaging voor vele toepassingen. De ontwikkeling van een nieuw protocol voor de levering heeft dus steeds meer belangstelling. Naast de methoden van de transfectie voor plasmide⁸ en mRNA⁹, virale levering gebaseerd op adenovirale^10,11, adeno-geassocieerde virale (AAV)¹², Baculovirus¹³, gammaretroviral,¹⁴ en lentivirale vectoren¹⁵ heeft voorgesteld in het verleden. Met name moet het systeem van keuze garanderen een voorbijgaande aflevering van de SB-onderdelen zonder integratie van de virale vector. Toch roept de constituerende uitdrukking van transposase bezorgdheid over de veiligheid als gevolg van het risico van een onbeheersbare rehopping van het transposon.

Daarom, transcriptionele regulering van SB100X door een verfijnde Tet-ON systeem is de eerste uitdaging. Een gemodificeerde Tet-responsieve promotor, verkregen door te vervangen door de oorspronkelijke promotor van het ontwikkelde minimale cytomegalovirus (CMV) met de minimale promotor (-81) van het gen Timidine Kinase (TK) van Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)¹⁶, wordt gekloond stroomopwaarts van de SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). De gemuteerde omgekeerde-tetracycline-transactivator rtTA2^s-M2¹⁷ onder de controle van de sterke constitutieve promotor (fosfoglyceraat promotor, PGK) gekloond in een verschillende plasmide wordt uitgedrukt (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). Wanneer toegevoegd aan het kweekmedium, dox bindt de rtTA2^s-M2 modulator en aanbinden van de promotor van de Tet complexe of, resulterend in strak gereguleerde inductie van SB100X expressie¹⁸.

De tweede belangrijke uitdaging vloeit voort uit de inefficiënte transfectie van menselijke primaire cellen door verschillende fysische en chemische methoden. Om efficiënt transposase in menselijke cellen resistent tegen transfectie, de SB100X en de rtTA2^s-M2 expressie cassettes worden verpakt in twee integratie defecte lentivirale vectoren (IDLVs)¹⁹: IDLVTKSB en IDLVrtTA2^s– M2. Virale vectoren worden Transient geproduceerd als derde generatie vectoren in HEK293T cellen²⁰ en pseudotyped met de glycoproteïne G van het Vescicular Stomatitis Virus (VSV-G), die een breed spectrum van infectie verleent. Vector deeltjes worden geconcentreerd door ultracentrifugatie en getitreerd met HIV-1 Gag p24 immunocapture. Als u wilt transduce cellijnen en primaire cellen, vector deeltjes zijn complexvorm met polybrene en worden geïncubeerd met de doelcellen in de aanwezigheid of afwezigheid van dox. Drug-afhankelijke activering van SB100X expressie in getransduceerde cellen wordt gemeten door kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)¹⁸.

Zodra het Tet-gereglementeerde SB100X expressie wordt aangetoond, volgt omzetting van de Indiase overheid (bijvoorbeeld groen fluorescent proteïne, GFP) in het genoom van de cel doelgroep de moleculaire gebeurtenissen die duidelijk geschematiseerde door Bak en Mikkelsen²¹. Een derde IDLV vector uitvoering een expressie cassette voor de Indiase overheid gekloond tussen de T2-transposon IRs (IDLVT2) moet worden gebouwd en verpakt zoals hierboven vermeld. Ten slotte, de drie IDLV vectoren kunnen worden gebruikt om efficiënt menselijke cellen (bv. primaire keratinocyten) in vitro transduce en integreren van de Indiase overheid in aanwezigheid van doxycycline¹⁸.

Protocol

1. plasmiden werkzaam Opmerking: Plasmide pCCL-PGKrtTA2S-M2 werd vriendelijk geleverd door Prof. Zappavigna (Universiteit van Modena en Reggio Emilia, Modena, Italië). De pCMVSB100X plasmide uitvoering de codering opeenvolging van hyperactieve transposase en pT2/BH transposon plasmide werden beschikbaar gesteld door Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Instituut, Langen, Duitsland) en Prof. Z. Izvak (Max Delbruck Center for Molecular Medicine, Berlin, Duitsland). Voor alle klonen …

Representative Results

Met behulp van de procedure die hier, drie IDLV vectoren uitvoering de gereglementeerde SB-onderdelen (SB100X, rtTA2S-M2 en T2-GFP transposon) waren verpakt en gebruikt voor het efficiënt leveren en strak regelen de SB-systeem in menselijke cellen. Figuur 1A blijkt een regeling voor de in vitro transductie van HeLa cellen, die werd uitgevoerd voor de evaluatie van de transcriptionele regulering van SB transposase met de beste dosis combin…

Discussion

Hier beschrijven we een breed toegankelijke methodologie om een Indiase stabiel te integreren in het genoom van doelcellen door Doornroosje-gemedieerde omzetting. Hoewel de SB-systeem werd ontwikkeld om een nonviral methode voor het bewerken van het genoom te bieden, is efficiënte levering van de machines van de integratie (transposase en T2 transposon) verplicht. Daarom gebruiken de SB-systeem op nauwelijks transfectable primaire cellen, werd een virale levering van SB componenten voortgezet in de afgelopen ja…

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	–	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	–	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	–	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	–	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	–	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	–	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	–	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	–	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	–	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	–	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	–	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.