Candida albicans में फिल्म निर्माण के दृश्य एक स्वचालित Microfluidic डिवाइस का उपयोग
Summary
इस प्रोटोकॉल एक अनुकूलन स्वचालित microfluidic डिवाइस के उपयोग के लिए Candida albicans में मेजबान शारीरिक स्थितियों के तहत फिल्म निर्माण कल्पना का वर्णन ।
Abstract
Candida albicans मनुष्य के सबसे आम कवक रोगज़नक़ है, अस्पताल के बारे में 15%-पूति मामलों का अधिग्रहण किया । सी. albicans की एक प्रमुख डाह विशेषता है, जो कि बायोटिक और अजैव सतहों से जुड़ी हुई कोशिकाओं के संरचित समुदायों को, के रूप में बनाने की क्षमता है । C. albicans जैव फिल्म होस्ट ऊतकों, जैसे श्लैष्मिक परतों, और चिकित्सा उपकरणों पर, जैसे कैथेटर, पेसमेकर, डेंचर, और संयुक्त कृत्रिम पर प्रपत्र कर सकते हैं । वे अत्यधिक शारीरिक और रासायनिक perturbations के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, क्योंकि जैव फिल्म महत्वपूर्ण नैदानिक चुनौतियों मुद्रा, और प्रसार संक्रमण बीज के लिए जलाशयों के रूप में कार्य कर सकते हैं. इन विट्रो परख में विभिंन ऐसे microtiter प्लेट परख, शुष्क वजन माप, सेल व्यवहार्यता परख के रूप में सी. albicans फिल्म गठन, अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है, और फोकल स्कैनिंग लेजर माइक्रोस्कोपी । इन सभी की परख एकल अंत बिंदु परख रहे हैं, जहां फिल्म निर्माण एक विशिष्ट समय बिंदु पर मूल्यांकन किया है । यहां, हम लामिना प्रवाह की स्थिति के तहत एक स्वचालित microfluidic डिवाइस का उपयोग कर वास्तविक समय में फिल्म निर्माण का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस विधि की अनुमति देता है के रूप में फिल्म के गठन के अवलोकन के लिए इस तरह के समय के साथ विकसित, अनुकूलनीय शर्तों का उपयोग कर रहे है कि उन लोगों के रूप में मेजबान की नकल, संवहनी कैथेटर में सामना करना पड़ा । इस प्रोटोकॉल को जेनेटिक म्यूटेंट के साथ-साथ रीयल-टाइम में फिल्मी विकास पर रोगाणुरोधी एजेंटों के निरोधात्मक इफेक्ट का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
Candida albicans मानव microbiota के एक खानेवाला सदस्य है, लेकिन यह भी एक अवसरवादी रोगज़नक़, सतही और गंभीर कवक संक्रमण के कारण1,2में सक्षम है । सी albicans की एक प्रमुख डाह विशेषता है अपने को लचीला और दवा प्रतिरोधी फिल्म फार्म, कोशिकाओं के समुदायों के एक सतह का पालन करने की क्षमता है और एक extracellular मैट्रिक्स सामग्री में संलग्न1,3। C. albicans फिल्म के उच्च संरचित कर रहे हैं, कई कोशिका प्रकार (दौर नवोदित खमीर-प्रपत्र कोशिकाओं, अंडाकार pseudohyphal कोशिकाओं, और ट्यूबलर hyphal कोशिकाओं)4की अनेक परतों से युक्त । C. albicans फिल्म विकास दौर खमीर के पालन के साथ शुरू होता है एक सतह के लिए फार्म का कोशिकाओं (बोने की संरचना), सतह पर इन कोशिकाओं के प्रसार के बाद, और फिर अपरिपक्व फिल्म संरचना की परिपक्वता में एक पूरी तरह से गठन किया है कि extracellular मैट्रिक्स सामग्री से घिरा हुआ है फिल्म4। परिपक्व फिल्म मुख्यतः लंबी hyphal कोशिकाओं से बना है कि घने और परस्पर नेटवर्क के रूप में, के लिए वास्तुकला स्थिरता प्रदान कर रहा है फिल्म4। इस फिल्म के जीवन चक्र के दौरान, गोल नवोदित खमीर कोशिकाओं परिपक्व फिल्म से फैलाने, और शरीर के अंय क्षेत्रों के लिए यात्रा कर सकते है प्रसार संक्रमण या बीज अंय साइटों4,5में नई फिल्मों का कारण । C. albicans बायोटिक सतहों पर, जैसे श्लैष्मिक सतहों और पूरे मेजबान ऊतक पर, और अजैव सतहों पर, जैसे कैथेटर, पेसमेकर, डेंचर, और कृत्रिम जोड़ों के रूप में कर सकते हैं । इस वजह से, वे बेहद कठिन है, और कई मामलों में, केवल प्रभावी उपचार रणनीति संक्रमित डिवाइस को हटाने के लिए है4में । यह इस प्रकार नैदानिक सेटिंग्स में मनाया उन के लिए इसी तरह की शर्तों के तहत फिल्म निर्माण की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
सी. albicans 6,7,8के अध्ययन के लिए प्रयुक्त vivo पशु मॉडलों में कई महत्वपूर्ण हैं; हालांकि, इन अध्ययनों महंगा हो सकता है, समय लगता है, और उपभेदों और रोगाणुरोधी एजेंटों की संख्या है कि एक निश्चित समय पर परीक्षण किया जा सकता द्वारा सीमित कर रहे हैं । इन विट्रो में दूसरी ओर फिल्म परख, तेजी से, उच्च रोधी यौगिकों और उत्परिवर्ती उपभेदों के प्रवाह का आकलन करने के लिए अनुमति देते हैं, और कर रहे है और अधिक लागत प्रभावी और नैतिक फिल्म की तुलना में एथिकल पशु मॉडल9में किए गए परख, 10,11,12,13,14. यहां हम इन विट्रो परख का वर्णन है कि हम विकसित और लामिना प्रवाह के तहत एक अनुकूलन microfluidic डिवाइस14,15का उपयोग करते हुए अस्थाई फिल्म गठन का पालन अनुकूलित । परख, प्रारंभिक पालन कदम, सेल प्रसार, फिल्मी परिपक्वता, और सेल फैलाव सहित, फिल्म निर्माण के प्रत्येक चरण के दृश्य के लिए अनुमति देता है । परख भी एक फिल्म के विकास में सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन कल्पना उपयोगी है ।
Microtiter प्लेटें, जो आम तौर पर इन विट्रो में के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि उच्च प्रवाह, नियंत्रित प्रवाह की स्थिति के लिए अनुमति नहीं है । पारंपरिक लामिना फ्लो सेल सिस्टम नियंत्रित प्रवाह की स्थिति में लगातार फिल्म गठन के आकलन के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन इन अक्सर समय के लिए स्थापित करने के लिए और सीमित गतिशील रेंज नियंत्रण और प्रवाह है करते हैं । microfluidic डिवाइस यहां का उपयोग उच्च प्रवाह प्लेटों के संयोजन से इन सीमाओं पर काबू (४८ कुओं युक्त) एक निर्मित लामिना प्रवाह कक्ष के साथ और उच्च प्रतिलिपि, बहुमुखी है, और अनुकूलन ।
यहां, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित microfluidic डिवाइस के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक जंगली-type C. albicans तनाव, एक के विकास पर एक ज्ञात रोधी एजेंट के प्रभाव के निर्माण का आकलन करने के लिए, और फिल्म दो उत्परिवर्ती उपभेदों में गठन (bcr1Δ/Δ और efg1 Δ/Δ) है कि पहले से इन विट्रो में और vivo16,17,18में फिल्मी दोष है की सूचना दी गई । वर्णित प्रोटोकॉल एक फिल्म के विकास के दौरान में बाधा फिल्म गठन को बाधित में रोगाणुरोधी एजेंटों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और उत्परिवर्ती पुस्तकालयों स्क्रीनिंग द्वारा सामान्य फिल्म विकास के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
अनुकूलन योग्य microfluidic फिल्म परख यहां वर्णित एक ही सेल स्तर पर वास्तविक समय में फिल्म निर्माण के दृश्य के लिए अनुमति देता है जब एक निश्चित दर लामिना प्रवाह और लगातार तापमान के संपर्क में । यह जंगली प्रकार औ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Nobile लैब के सभी सदस्यों को फिल्म की परख पर उपयोगी चर्चा के लिए धंयवाद । इस अध्ययन में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) अनुदान R21 AI125801 (to C.J.N.) का समर्थन किया गया था. D.L.R. मेक्सिको और संयुक्त राज्य अमेरिका (UC-MEXUS) और Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT) के लिए कैलिफोर्निया संस्थान के विश्वविद्यालय से डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
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