Souris adulte DRG Explant et dissocié des modèles cellulaires pour étudier la neuroplasticité et réponses aux agressions environnementales y compris l’Infection virale
Summary
Dans le présent rapport, les avantages de culture organotypique et dissocié des cultures primaires des ganglions rachidiens provenant de souris sont mises en évidence afin d’étudier un large éventail de mécanismes associés aux interactions neurone-gliales, neuroplasticité, neuroinflammation et réponse à l’infection virale.
Abstract
Ce protocole décrit un modèle ex vivo de souris-dérivé de la racine dorsale ganglions (GRD) explant et in vitro dérivées de DRG co-culture de dissocié des neurones sensoriels et les cellules gliales par satellite. Ce sont des modèles pour étudier diverses réactions biologiques associés à des troubles physiologiques et pathologiques du système nerveux périphérique (PNS) allant des interactions neurone-gliales, neuroplasticité, utiles et polyvalents neuro-inflammation et infection virale. L’utilisation de l’explant DRG est scientifiquement avantageuse par rapport aux modèles de cellules individuelles simpliste pour de multiples raisons. Par exemple, comme une culture organotypique, l’explant DRG permet aux ex vivo le transfert d’un réseau neuronal entier, y compris le microenvironnement extracellulaire qui jouent un rôle important dans toutes les fonctions neuronales et gliales. En outre, DRG explants peuvent également être maintenus ex vivo pour plusieurs jours et les conditions de culture peuvent être perturbées comme vous le souhaitez. En outre, le PMSI récolté peut être dissocié de plus dans une culture mixte in vitro de neurones sensitifs primaires et de cellules gliales par satellite pour étudier les interactions neuronales et gliales, neuritogenesis, interaction cône axonal avec l’extracellulaire microenvironnement et plus généralement, tout aspect lié au métabolisme neuronal. Par conséquent, le système DRG-explant offre une grande flexibilité pour étudier un large éventail d’événements liés à des conditions biologiques, physiologiques et pathologiques de manière rentable.
Introduction
Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode pour obtenir un modèle ex vivo d’organotypique d’un système de modèle DRG souris dérivé comme un micro-environnement tissu préservé pour enquêter sur un large éventail de réactions biologiques aux insultes PNS allant de neurone-gliales interaction, neuroplasticité, marqueurs de l’inflammation, d’infection virale. En outre, nous avons développé plus loin un protocole visant à créer une co-culture primaire de neurones sensoriels unique DRG-dérivés et de cellules satellites.
La DRG sont gris-matière-unités satellites situés à l’extérieur du système nerveux central (CNS) le long des racines spinales dorsales des nerfs rachidiens. Le PMSI, situé à proximité du foramen intervertébral, neurones sensoriels neurone de maison et les cellules gliales par satellite. Les neurone neurones comportent une neurite unique qui se divise en un processus périphérique transportant des apports somatiques et viscérales des périphériques cibles au corps cellulaire et un processus central qui soumet des informations sensorielles du corps cellulaire dans le SNC. Une capsule conjonctive définit et isole ce périphérique cluster des neurones et les cellules gliales du SNC. Aucune migration cellulaire postnatal vers ou à partir de la DRG n’a jamais été décrite et une niche de cellules souches locales est responsable de neurogènes événements qui ont lieu tout au long de la vie1. Par conséquent, ce modèle est particulièrement adapté pour étudier la neurogenèse adulte, axonogénèse, réponse à une lésion traumatique et cellule mort2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Dans le domaine de la neurogenèse, le PMSI récoltées en vivo et explantés in vitro reproduit axonotmésis, une condition de blessures dans les axones sont entièrement rompus et le corps cellulaire neuronal est déconnectée de la cible innervée10 ,11. Il est bien connu que les lésions du nerf périphérique peuvent provoquer l’expression des gènes une diminution et une augmentation dans le PMSI et bon nombre de ces changements sont le résultat de processus de régénération mais beaucoup peuvent aussi être le résultat de la réponse immunitaire ou un autre des cellules non neuronales. En utilisant un ex vivo système de DRG isolé, certaines de cette complexité est retiré et voies mécanistiques puissent être étudiés plus facilement.
En plus de son rôle central dans la transmission des influx sensitifs à la CNS, l’abondance des récepteurs de nombreux neurotransmetteurs dont GABA12,13,14,15 au niveau du soma neuronal ainsi que preuve d’excitation croisée interneuronales peut suggèrent que les DRG sont sophistiqués intégrateurs préliminaires des inputs sensoriels16,17. Ces nouveaux résultats confèrent à l’explant DRG les caractéristiques d’un système de réseau neuronal-mini semblable à d’autres modèles de « mini-cerveau », qui sont organoïdes nerveux-tissu-spécifique utilisé pour des champs expérimentaux plus larges enquête et thérapeutique approche de maladies neurologiques18,19. Ces témoignages ainsi que le fait que le PMSI est un groupe discret et bien défini du tissu neuronal entouré par une capsule conjonctive, en font un organe approprié pour ex vivo de transplantation.
Culture souris DRG présente une option attrayante multicellulaire pour modéliser les pathophysiologies humaines en raison de similitudes structurales et génétiques entre les espèces. En outre, un grand dépôt de lignées de souris transgéniques est très propice à futures études mécanistes. Extension de neurites fois au cours du développement et après une lésion nécessite des interactions mécaniques entre croissance cône et substrat de20,21. Nano et micro-aux motifs de substrats ont servi d’outils pour diriger la croissance neuritique et démontrer leur capacité à répondre à des caractéristiques topographiques dans leurs biocénoses. Les neurones ont démontré que survivre, adhérer, migrer et orienter leurs axones pour naviguer dans les caractéristiques de surface tels que les rainures dans les substrats22,23. Toutefois, ces études ont utilisé généralement de lignées de cellules cultivées et il est difficile de prédire comment les cellules primaires neuronale volonté répondre aux repères bien définis, physique in vivo ou ex vivo.
Le modèle ex vivo explant de souris DRG utilisée pour cette proposition imite l’interaction cellule-cellule réelle et les signaux biochimiques qui entourent les axones croissantes. Parmi beaucoup d’autres paradigmes expérimentaux, allant de la régénération axonale, Neurosphère production, à la neuro-inflammation, le PMSI explantation modèle continue à servir comme un outil précieux pour étudier l’aspect viral infection et latence dans sensorielle les ganglions24,25,26,27.
Le système nerveux (NS) est en général de cible pour les infections virales28,29,30. La plupart des virus infectent la surface des cellules épithéliales et endothéliales et font leur chemin dans les tissus de surface à la NS par l’intermédiaire de nerf périphérique des fibres sensorielles et motrices. En particulier, le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) après une infection initiale dans les cellules épithéliales établit un temps de latence long de la vie dans les ganglions sensitifs de préférence, le PMSI du PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacité d’infecter le PNS conduit finalement à des maladies neurologiques,33.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle DRG ex vivo est extrêmement utile d’examiner un large éventail d’événements comme des interactions neurone-glie, ainsi que l’effet du microenvironnement sur ces deux métabolismes neuronales et gliales37. En outre, le DRG-modèle pourrait servir comme un outil économique pour répondre à des questions pertinentes en ce qui concerne le mécanisme pathogène et associés des marqueurs en développant ex vivo des systèmes pour la phase chronique et latente ai…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions sincèrement le laboratoire central de l’imagerie à Midwestern University (SM) et le groupe d’étudiants [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo et Casey Sigerson] pour leurs contributions en culture cellulaire et le travail d’imagerie. Ce travail de recherche a été financé par de la SM intra-muros subvention des fonds de démarrage M.F. et recherche de V.T.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
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