Seguimiento Neuroanatomical retrógrada frénico de neuronas de Motor en ratones
Summary
Aquí, describimos un protocolo para la identificación de las neuronas de motor frénicas en ratones después entrega intrapleural de fluoróforo conjugada beta de la subunidad de la toxina de cólera. Se comparan dos técnicas para inyectar en la cavidad pleural: transdiaphragmatic versus enfoques transtorácicos.
Abstract
Neuronas motoras frénicas son las neuronas de motor cervicales origina de C3 a C6 niveles en especies de mamíferos más. Proyecciones axonales convergen en nervios frénicos que inervan el diafragma respiratorio. En cortes de médula espinal, las neuronas de motor frénicas no puede ser identificadas desde otras neuronas del motor en criterios morfológicos o bioquímicos. Ofrecemos la descripción de procedimientos para la visualización de cuerpos celulares de neuronas motoras frénicas en ratones, siguiente inyección intrapleural de cólera toxina subunidad beta (CTB) conjugado con un fluoróforo. Este trazador fluorescente neuroanatomical tiene la capacidad de ser cogido para arriba en la Unión neuromuscular del diafragma, retrogradely a lo largo de los axones frénicos y llegar a los cuerpos celulares frénicos. Se comparan los dos enfoques metodológicos de la entrega CTB intrapleural: transdiaphragmatic versus inyecciones transtorácicas. Ambos métodos son exitosos y resultan en similar número de neuronas de motor frénicas CTB-labeled. En conclusión, estas técnicas pueden ser aplicadas para visualizar o cuantificar las neuronas motoras frénicas en varios estudios experimentales como los que se centra en los circuitos de frénico diafragma.
Introduction
El objetivo del estudio es presentar un método confiable para identificar las neuronas motoras frénicas (PhMN) en las secciones de la médula espinal de ratón. Inyección de un trazador fluorescente neuroanatómicas en la cavidad pleural fue elegida como el método de entrega para alcanzar las proyecciones neuromusculares frénicas hacia el diafragma y utilizar transporte retrógrado a lo largo de los axones frénicos a frénicos cuerpos celulares de la etiqueta. Se describen dos técnicas de entrega intrapleural: transdiaphragmatic versus transtorácico.
Frénico las neuronas motoras son las células espinales relé cuyos axones convergen en los nervios frénicos, que en última instancia inervan el diafragma. Estas son las neuronas motoras inferiores reciben la impulsión inspiratoria de los centros respiratorios bulbares y retransmisión a las uniones neuro-musculares del diafragma (NMJ). PhMN se estructuran en dos columnas motor, uno para cada hemicord, a lo largo de la mediados de-cervicales de la espina dorsal. En la mayoría de especies de mamíferos incluyendo a seres humanos, las columnas motor frénicas separada de niveles C3 a C61,2,3. Nosotros y otros hemos confirmado que PhMN concentrados en los niveles de C3-C5 en rata y ratón de la médula espinal4,5,6,7,8. La distribución topográfica de las células frénicas no es al azar; las neuronas motoras que inervan la parte esternal del diafragma están distribuidas más densamente en la parte craneal de la piscina de motor frénica (C3), mientras que las neuronas motoras que inervan la parte crural son más caudal (C5)9. Además, PhMN se agrupan vario en el cuerno ventral gris materia. Nivel C3, los racimos de células frénicos se encuentran lateralmente, luego que se muevan en una dirección ventrolateral e iliacos se encuentran en la más caudal niveles10,11.
Dado su papel vital durante la inspiración, es de suma importancia para identificar con precisión PhMN en la médula espinal sana pero también seguir su destino durante condiciones patológicas, tales como enfermedades degenerativas o lesiones traumáticas de la médula espinal. Desde PhMN no difieren morfológicamente de otras neuronas motoras cervicales, identificación de PhMN se basa en la entrega específica de neuroanatomical marcadores ya sea a nivel de centros respiratorios primarios8, o en el diafragma NMJ7 o en el nervio frénico4. El palpador es tomado por las fibras nerviosas y llevaron hasta el frénicos cuerpos celulares en la columna cervical, donde pueden visualizarse utilizando sistemas de detección directa o indirecta. Retrógrada o anterógrada trazadores son comercialmente disponibles con una amplia gama de conjugados. Notable, cada indicador está dotado no, bajas o altas capacidades seguimiento sináptica trans.
En el estudio actual, hemos elegido la subunidad beta de la toxina del cólera (CTB) funcionalizada con Alexa Fluor 555 (en adelante denominado CTB-fluoróforo) como una etiqueta fluorescente, que permite una visualización directa de PhMN en secciones congeladas de la médula espinal. CTB se describe generalmente como un trazador monosynaptic, aunque datos experimentales tienden a mostrar un paso transneuronal de12. CTB tiene la capacidad de enlazar el gangliósido GM1 en la membrana plasmática de la terminación nerviosa. CTB es internalizado a través clathrin-dependiente – independiente o mecanismos y transitan por la red trans-Golgi en el retículo endoplásmico en una manera retrógrada13,14. La internalización y el transporte retrógrado parecen ser dependiente en el citoesqueleto de actina15,16 , así como en la red de microtúbulos17.
Para demostrar la utilidad de la CTB como trazador neuroanatomical retrógrada etiquetado diafragma PhMN circuitos, CTB-fluoróforo entregaron intrapleural. CTB se administró dos técnicas: la primera de ellas incluye una laparotomía y múltiples inyecciones transdiaphragmatic; el segundo, menos invasiva, utiliza una única inyección transtorácica. Cuatro días más tarde, marcada con fluorescencia PhMNs fueron cuantificados en la médula espinal cervical, tanto de sanos y de animales (C4) spinally heridos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito en este documento puede aplicarse a cualquier cepa de ratones adultos o a cualquier paradigma experimental en el que se debe evaluar la integridad de los circuitos de diafragma PhMN. Por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y lesión de la médula espinal cervical (cSCI) son condiciones asociadas con pérdida de PhMN, degeneración anterógrada de axones frénicos y posterior compromiso respiratorio. Modelos animales de ELA o cSCI mímico histopatológicos y funcionales respiratorios défi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Robert Graffin y Pauline Duhant su soporte técnico.
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
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