Retrograd neuroanatomiska spårning av Phrenic motoriska nervceller hos möss
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att identifiera phrenic motoriska nervceller hos möss efter intrapleural leverans av fluorophore konjugerat kolera toxin subenhet beta. Två tekniker jämförs för att injicera pleural hålighet: transdiaphragmatic kontra transtorakal metoder.
Abstract
Phrenic motoriska nervceller är livmoderhalscancer motoriska nervceller med ursprung från C3 till C6 nivåer i de flesta däggdjursarter. Axonal prognoser konvergerar i phrenic nerver innervating respiratoriska membranet. I ryggmärgen skivor, kan inte phrenic motoriska nervceller identifieras från andra motoriska nervceller på morfologiska eller biokemiska kriterier. Vi tillhandahåller en beskrivning av förfaranden för att visualisera phrenic motorneuronen cellen organ hos möss, följande intrapleural injektioner av kolera toxin subenhet beta (CTB) konjugerat till en fluorophore. Detta fluorescerande neuroanatomiska tracer har förmågan att fångas upp i mellangärdet neuromuskulära korsningen, retrogradely ryckas phrenic axoner och nå de phrenic cell organ. Två metoder intrapleural CTB leveransdatum jämförs: transdiaphragmatic kontra transtorakal injektioner. Båda metoderna är framgångsrika och resultera i liknande antal CTB-märkt phrenic motoriska nervceller. Sammanfattningsvis, kan dessa tekniker användas för att visualisera eller kvantifiera de phrenic motoriska nervcellerna i olika experimentella studier som de fokuserade på den membran-phrenic kretsen.
Introduction
Syftet med studien är att lägga fram en tillförlitlig metod för att identifiera phrenic motoriska nervceller (PhMN) på mus ryggmärgen sektioner. Injektion av fluorescerande neuroanatomiska spårämne i pleural hålighet valdes som leveransmetod att nå phrenic neuromuskulära prognoserna på membranet och använda retrograd transport längs phrenic axoner för att namnge phrenic cellen organ. Två tekniker intrapleural leveranssätt beskrivs: transdiaphragmatic kontra transtorakal.
Phrenic motoriska nervceller är spinal relä celler vars axoner konvergerar in phrenic nerver, som i slutändan innerverar membranet. Dessa är lägre rörelse neuronerna emot inspiratorisk enheten från bulbar respiratoriska centra och vidarebefordra det till membran neuro-muskulära korsningar (NMJ). PhMN är strukturerade i två motor kolumner, en för varje hemicord, kör längs mitten av-halsryggen. De flesta däggdjur, inklusive människor, sprida phrenic motor kolumnerna från nivåer C3 till C61,2,3. Vi och andra har bekräftat att PhMN koncentreras till C3-C5 nivåer i råtta och mus ryggmärgen4,5,6,7,8. Topografiska fördelningen av phrenic celler är inte slumpmässigt; motoriska nervceller innervating de sternala delen av membranet distribueras mer tätt i den kraniella delen av phrenic motor poolen (C3), medan motor neuron innervating den crural delen är mer kaudalt (C5)9. Dessutom är PhMN grupperade omväxlande i den ventrala horn grå substans. På C3-nivå, kluster av phrenic celler ligga sidled, då de skifta i en ventrolaterala riktning och ventromedially hittas på mest kaudala nivåer10,11.
Med tanke på deras avgörande roll under inspiration, är det av yttersta vikt att korrekt identifiera PhMN i friska ryggmärgen men också följa deras öde under sjukdomstillstånd, till exempel degenerativa sjukdomar eller traumatiska skador i ryggmärgen. Eftersom PhMN inte skiljer sig morfologiskt från andra livmoderhalscancer motoriska nervceller, bygger identifiering av PhMN på riktade leverans av neuroanatomiska spårämnen antingen på nivå i primära respiratoriska centra8, eller på den membran NMJ7 eller den phrenic nerv4. Spårämne är tas av nervfibrer och transporteras upp till phrenic cell organ i halsryggen, där det kan visualiseras med hjälp av direkta eller indirekta detektionssystem. Retrograd eller anterograd spårämnen är kommersiellt tillgängliga med ett brett spektrum av konjugat. Anmärkningsvärd, varje spårämne begåvas med nej, låga eller höga förmågor för trans synaptic spårning.
I den aktuella studien valde vi den beta subuniten av kolera toxinet (CTB) functionalized med Alexa Fluor 555 (hädanefter benämnd CTB-fluorophore) som en fluorescerande etikett, möjliggör en direkt visualisering av PhMN på frysta ryggmärgen sektioner. CTB beskrivas brukar som monosynaptic spårämne även om experimentella data tenderar att visa en transneuronal passage12. CTB har förmågan att binda ganglioside GM1 på plasmamembranet av nervänden. CTB är internaliserad via clathrin-beroende eller -oberoende mekanismer och traffics genom trans-Golgi nätverket i det endoplasmatiska retiklet i en retrograd mode13,14. Internalisering och retrograd transport verkar vara beroende på aktin cytoskelettet15,16 samt på mikrotubulära nätverket17.
För att påvisa nyttan av CTB som retrograd neuroanatomiska spårämne märkning membran-PhMN kretsar, levererades CTB-fluorophore intrapleurally. CTB administrerades med hjälp av två tekniker: ena ingår en laparotomi och flera transdiaphragmatic injektioner; den andra en, mindre invasiva, används en unik transtorakal injektion. Fyra dagar senare, fluorescently-märkt PhMNs kvantifierades i cervikala ryggmärgen från både från friska och spinally-skadade (C4) djur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskrivs häri kan tillämpas till någon stam av vuxna möss eller några experimentella paradigm där integriteten av membran-PhMN kretsen bör utvärderas. Exempelvis är amyotrofisk lateralskleros (ALS) och cervikal ryggmärgsskada (cSCI) villkor som är förknippade med PhMN förlust, anterograd degeneration av phrenic axoner och efterföljande respiratorisk kompromiss. Djurmodeller av ALS eller cSCI härma histopatologiska och funktionella respiratoriska underskott som observerats i mänskliga sjukdomar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma att Robert Graffin och Pauline Duhant för deras tekniska support.
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
