El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación
Summary
Un modelo animal es necesario para descifrar el papel de las células del tumor (CTC) en la promoción de la colonización durante la metástasis del cáncer de pulmón en circulación. Aquí, hemos establecido y realizado con éxito un en vivo ensayo a prueba específicamente el requisito de fibronectina poliméricos (polyFN) Asamblea CTC para la colonización del pulmón.
Abstract
La metástasis es la principal causa de muerte por cáncer. El papel de la circulación de las células del tumor (CTC) en la promoción de metástasis del cáncer, en el cual la colonización pulmonar por CTC críticamente contribuye a principios procesos metastásicos de pulmón, se ha investigado vigorosamente. Así, los modelos animales son el único enfoque que captura el proceso completo sistémico de metástasis. Teniendo en cuenta que tiene problemas en los diseños experimentales para examinar las contribuciones de CTC a la extravasación de los vasos sanguíneos, se estableció un ensayo de colonización en vivo pulmón en que a largo plazo la fluorescencia de la célula-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl éster (CFSE), fue utilizado para identificar células tumorales suspendido y perfusión del pulmón fue realizada para claro no específicamente atrapado CTC antes de la extirpación de pulmón, proyección de imagen confocal y la cuantificación. Polimérico fibronectina (polyFN) montado en superficies CTC se ha encontrado para mediar la colonización del pulmón en el establecimiento final de los tejidos del tumor metastásico. Aquí, para probar específicamente el requisito de polyFN Asamblea CTC para la colonización del pulmón y la extravasación, se realiza a corto plazo ensayos de colonización pulmonar en el cual suspendieron Lewis lung carcinoma células (SRL) estable expresan FN-shRNA (shFN) o despegue en tiempo mínimo-shRNA (shScr) y previamente con 20 μM de CFSE fueron inoculados por vía intravenosa en ratones C57BL/6. Hemos demostrado con éxito que las capacidades de las células LLC shFN para colonizar los pulmones de ratón fueron disminuidas significativamente en comparación con las células LLC de shScr. Por lo tanto, esta metodología a corto plazo puede ser ampliamente aplicada para demostrar específicamente la capacidad de CTC dentro de la circulación para colonizar los pulmones.
Introduction
La metástasis es la principal causa de muerte de cáncer1,2. Las células tumorales derivadas de tejidos primarios entrar en la circulación en suspensión y sobreviven varios desafíos hematógenas, por ejemplo, anoikis, inmunes agresiones y daños debido a la tensión de esquileo de la tensión arterial o las limitaciones geométricas, antes de que se capaz de colonizar órganos distantes, un paso clave que dicta el éxito de metástasis3,4,5,6. Por lo tanto, actualmente se han hecho esfuerzos vigorosos en la caracterización de las células tumorales circulantes (CTC) y la correlación de estas características con la malignidad del tumor, metástasis y tasas de supervivencia de cáncer pacientes7,8 , 9. puesto que el proceso de metástasis del cáncer específicamente describe un evento en vivo , modelos animales son el único enfoque que captura el proceso completo sistémico de metástasis10,11,12 .
CTC se convierten en los tejidos del tumor metastásico a través de varios eventos celulares, incluyendo la colonización de órganos distantes1,2. Sin embargo, la metástasis más utilizados ensayos13,14,15 no proporcionan una manera de observar la colonización de CTC de órganos distantes. Por lo tanto, es urgente un diseño de ensayo en vivo para la visualización de colonización de CTC. Aunque varios in vivo y ex vivo corta desventajas, problemas y colonización de pulmón del término se han diseñado ensayos permanecen. Por ejemplo, mientras que la proteína de fluorescencia verde (GFP)-expresando tumor las células se han utilizado en estos ensayos de22,23, se necesita tiempo para transfectar estable y clon de células tumorales con suficiente intensidad fluorescente GFP bajo el microscopio. Del mismo modo, aunque la coloración transitoria de las células del tumor con el rastreador de celulares a largo plazo CFSE se ha empleado para reemplazar las células del tumor expresando GFP, sigue siendo difícil juzgar si las células tumorales marcados con CFSE se adjuntan o simplemente presentes dentro de la vasculatura del suprimido órganos distantes16,17.
Polimérico fibronectina (polyFN) montado en superficies de CTC se ha encontrado para contribuir críticamente al establecimiento final del tumor metastático tejidos18,19,20,21,22 . Aquí, se realizaron a corto plazo ensayos de colonización pulmonar en que células de carcinoma de pulmón Lewis suspendidos (SRL) estable expresando FN-shRNA (shFN) o scramble-shRNA (shScr) y previamente etiquetado con CFSE fueron inoculados por vía intravenosa en ratones C57BL/6. Después de 2-3 días, los pulmones de ratón fueron perfundidos primero con tampón fosfato salino (PBS) para eliminar completamente la CTC suelto dentro de la vasculatura antes de ser sometido a microscopia confocal y la cuantificación de colonización pulmonar limitada. Demostró claramente que los números de colonización pulmonar shFN sociedad de responsabilidad limitada y los nódulos del tumor se redujeron significativamente en comparación con el shScr sociedad de responsabilidad limitada, corroborando sustancialmente el papel de la Asamblea polyFN el CTC en la facilitación de la colonización y el crecimiento de CTC en la pulmones. Nuestro estudio requiere más investigación para el papel de polyFN en metástasis del cáncer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Junto a largo plazo pulmonar colonización ensayos, corto plazo metodología empleamos aquí evaluar en vivo pulmón colonización por CTC en órganos distantes claramente dio a conocer y distingue el papel específico de polyFN montado en CTC en colonización los pulmones, que luego condujeron a la extravasación y procesos metastásicos18,19,20,21. Aunque etiquetado células con rast…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Chang Ming-Min y Ya-Hsin contactar su soporte técnico. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de ciencia y tecnología de Taiwán (la mayoría-103-2325-B-006-009, la mayoría-104-2325-B-006-001, la mayoría-105-2325-B-006-001 y MOST-106-2320-B-006-068-MY3) y el Ministerio de salud y bienestar (MOHW106-TDU-B-211-144004). Agradecemos también el apoyo del laboratorio de investigación central de la Facultad de medicina de la Universidad Nacional Cheng Kung, su microscopio confocal del multi-photon.
Materials
| Material | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
| Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
| L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
| Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
| Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
| Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
| 15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |
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