JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Recherche en cancérologie

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Published: June 16, 2018
doi:
10.3791/56761
, , , , , ,
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine,National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine,National Cheng Kung University, 3Trauma Office,Children’s National Health System

Summary

Bir hayvan modeli tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz sırasında akciğer kolonizasyon teşvik dolaşan rolü deşifre için gereklidir. Burada kurduk ve başarıyla gerçekleştirilen bir vivo içinde tahlil özel olarak test etmek için gereksinimin akciğer kolonizasyon için CTCs polimer fibronektin (polyFN) Meclisi.

Abstract

Metastaz kanser ölüm başlıca nedenidir. Tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz, içinde akciğer kolonizasyonu CTCs tarafından katkıda eleştirel için erken akciğer metastatik oluşum, teşvik dolaşan rolü şiddetle araştırmış. Bu nedenle, hayvan modelleri metastaz tam sistemik süreci yakalar tek yaklaşım vardır. Verilen bu CTCs katkılar kan damarı ekstravazasyonu incelenmesi için önceki Deneysel tasarımlar sorun oluşursa, biz hangi bir in vivo akciğer kolonizasyon tahlil kurulan bir uzun vadeli floresans hücre-izleyici, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), askıya alınan tümör hücreleri etiketlemek için kullanılan ve akciğer perfüzyon akciğer Temizleme, confocal görüntüleme ve miktar önce özellikle kapana CTCs temizlemek için gerçekleştirildi. Polimer fibronektin (polyFN) CTC yüzeylerde monte akciğer kolonizasyon metastatik tümör doku son kurulmasında aracılık tespit edilmiştir. Burada, özellikle CTCs polyFN derlemede akciğer kolonizasyon ve ekstravazasyonu için gereksinim test etmek için biz kısa vadeli gerçekleştirilen akciğer kolonizasyon deneyleri hangi askıya stabil FN-shRNA (shFN) ifade Lewis Akciğer Karsinomu Hücre (LLCs) veya Scramble-shRNA (shScr) ve önceden etiketli 20 mikron CFSE intravenöz C57BL/6 fareler aşılanmış. Biz başarıyla fare akciğerlerde kolonize etmek shFN LLC hücreleri yeteneklerini shScr LLC hücreleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalmış gösterdi. Bu nedenle, özellikle CTCs yeteneğini akciğerlerde kolonize dolaşım içinde göstermek için kısa vadeli bu yöntemi yaygın olarak uygulanabilir.

Introduction

Metastaz kanser ölüm1,2önemli nedenidir. Birincil dokulardan türetilmiş tümör hücreleri kan dolaşımı süspansiyon girin ve önce onlar are çeşitli Hematojen zorluklar, Örneğin, anoikis, bağışıklık saldırı ve zararlar tansiyon ya da geometrik kısıtları, yamultma stres nedeniyle hayatta uzak organ metastazı3,4,5,6başarı dikte önemli bir adım kolonize etmek mümkün. Bu nedenle, dinç çabaları şu anda dolaşımdaki tümör hücreleri (CTCs) karakterize ve bu özellikleri tümör habis, metastaz ve sağkalım oranları kanser hastaları7,8 ile korele yapılmıştır , 9. kanser metastaz işlemini özellikle vivo içinde olay gösterir, hayvan modelleri metastaz10,11,12 tam sistemik süreci yakalar tek yaklaşım vardır .

CTCs metastatik tümör doku uzak organlara1,2kolonizasyon dahil olmak üzere birden çok hücresel olaylar aracılığıyla olur. Ancak, en yaygın kullanılan metastaz deneyleri13,14,15 değil uzak organlara kolonizasyon CTC gözlemlemek için bir yol sağlar. Bu nedenle, bir CTC kolonizasyon görselleştirme için in vivo tahlil tasarım acilen ihtiyacım vardı. Her ne kadar birkaç vivo içinde ve ex vivo kısa dönem akciğer kolonizasyon deneyleri tasarlanmış, sorunları ve dezavantajları kalır. Örneğin, yeşil floresans protein (GFP) iken-overexpressing tümör hücreleri bu kullanılmıştır deneyleri22,23, stabil transfect ve yeterli GFP floresan yoğunluğu altında ile tümör hücreleri clone için sürüyor mikroskop. Her ne kadar uzun vadeli hücre izleyici CFSE ile tümör hücrelerinin geçici boyama GFP ifade tümör hücreleri değiştirmek için istihdam edilmiş, benzer şekilde, bu zor CFSE etiketli tümör hücreleri bağlı olup olmadığını yargılamak ya da sadece mevcut içinde kalır damarlara eksize uzak organlara16,17.

Polimer fibronektin (polyFN) CTCs yüzeylerde monte eleştirel metastatik tümör doku18,19,20,21,22 son kurulması için katkıda bulundu . Burada, kısa vadeli askıya alınmış Lewis Akciğer Karsinomu (LLCs) hücreleri stabil FN-shRNA (shFN) veya scramble-shRNA (shScr) ifade ve CFSE ile önceden etiketli akciğer kolonizasyon deneyleri intravenöz C57BL/6 fareler aşısını gerçekleştirilen. 2-3 gün sonra fare akciğerler ilk fosfat tamponlu tuz (tabi önce bekâr CTCs damarlara içinde tamamen kaldırmak için PBS) ile confocal mikroskobu ve akciğer kolonileşmesi LLCs miktar periosteum. Biz açıkça akciğer kolonileşmesi shFN LLCs sayıda ve tümör nodüller önemli ölçüde shScr önemli ölçüde CTCs polyFN derlemede rolü kolonizasyon ve CTCs içinde gelişimini kolaylaştıran corroborating LLCs ile karşılaştırıldığında azalma olduğunu göstermiştir Akciğerler. Bizim çalışma daha fazla rol için incelenmesi kanser metastaz polyFN garanti eder.

Protocol

Bizim Enstitüsü (bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının, NCKU Tıp Fakültesi Kılavuzu) esaslarına göre fareler üzerinde tüm deneyler yapıldı. 1. hazırlanması aletleri, Kültür Medya ve yemekleri Steril Cerrahi dikişler, 1 mL şırınga ile 26 G/0.5 cm iğne (için kuyruk ven enjeksiyon), deneysel protokoller başlamadan önce elde etmek 3 mL batar (için akciğer perfüzyon), 24G/3 cm iğne ile Dulbecco’nın modifiye kartal medya (DMEM), tripsin-EDTA çözüm (…

Representative Results

Vivo akciğer kolonizasyon tahlil gerçekleştirmeden önce akciğer kolonizasyon ve/veya metastaz, kolaylaştırma ekstravazasyonu polyFN askıya alınmış tümör hücreleri üzerinde aracılık olup olmadığını sınamak için Şekil 1A gösterildiği gibi biz ilk farklı titre CFSE, hücre geçirgen ve kovalent hücre içi Amin içeren moleküller26,27 ‘ askıya alınan tümör hücrel…

Discussion

Uzun vadeli akciğer kolonizasyon deneyleri, burada in vivo akciğer kolonizasyonu CTCs tarafından uzak organlarda değerlendirmek için istihdam metodoloji açıkça örtüsünü açmak ve kolonileşmesi içinde CTCs üzerinde monte polyFN belirli rol Ayrıştırılan kısa vadeli ile birlikte akciğer, ekstravazasyonu ve metastatik işlemleri18,19,20,21yol açtı. Her ne kadar uzun …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Ming-Min Chang ve Bayan Ya-Hsin Cheng ve teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Tayvan’ın Bakanlığı Bilim ve teknoloji tarafından desteklenmiştir (en-103-2325-B-006-009, en-104-2325-B-006-001, en-105-2325-B-006-001 ve MOST-106-2320-B-006-068-MY3) ve Sağlık Bakanlığı ve refah (MOHW106-TDU-B-211-144004). Biz de onların çok foton confocal mikroskop için destek için minnettar College of Medicine, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi, temel araştırma laboratuardan vardır.

Materials

Material
Bovine Serum Albumin (BSA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-9048-46-8
Bouin's Fluid MCC(medical chemical corporation)/POISON 456-A-1GL
CFSE Proliferation Dye ebiosciences 65-0850-85 Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)  (Gibco)ThermoFisher Scientific 12100-061
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-6381-92-6 For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) 
Fetal bovine serum (FBS) (Gibco)ThermoFisher Scientific 10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC) ATCC, Manassas, VA, USA CRL-1642
L-Glutamine, USP  (Gibco)ThermoFisher Scientific 21051-024
Potassium chloride (KCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7447-40-7 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7778-77-0 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )
Sodium chloride (NaCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7647-14-5 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-10039-32-4 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )
Trypan Blue Sigma Aldrich T6146 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS
Trypsin Sigma Aldrich T4799 For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )
Zoletil 50 Virbac To dilute with 1X PBS 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420 KUBOTA Co. 2420
Culture dish (6cm) Wuxi NEST Biotechnology Co. 705001
Disposable syringe (with needle) Perfect Medical Industry Co. 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
End over end mixer C.T.I YOUNG CHENN TS-20 For suspended cells recovery 
FACSCalibur (FACS) BD biosciences
Forceps Dimeda 10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc. HEPA CLASS 100
Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) Stoelting 51338
Multiphoton Confocal Microscope BX61WI Olympus FV1000MPE
Neubauer counting chamber Marienfeld-Superior 640010
Surgical scissor Dimeda 08.370.11
Surgical sutures  UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. NO. 0034 Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL microcentrifuge tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001
15 mL Greiner tube Greiner bio-one 188271
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells – mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
  4. Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  5. Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
  6. Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
  7. Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  8. Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
  9. Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
  10. Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
  11. Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
  12. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
  13. van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
  14. Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
  15. Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
  16. von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
  17. Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
  18. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
  19. Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
  20. Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
  21. Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
  22. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
  23. Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
  24. Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
  25. Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
  26. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  27. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  28. Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
  29. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  30. Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
  31. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  32. Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
  33. Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
  34. Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
  35. Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
  36. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
  37. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  38. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  39. Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
  40. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  41. Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
  42. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  43. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  44. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  45. Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
  46. Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
  47. Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
  48. Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
  49. Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
  50. Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
  51. Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
  52. Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
  53. Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
  54. Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
  55. Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
  56. Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
  57. Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
  58. Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
  59. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  60. Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
  61. Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
  62. Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).

Tags

Lung ColonizationCirculating Tumor CellsCancer MetastasisCell VisualizationCell CultureTrypsin-EDTACell SuspensionCentrifugationCFSETail Vein InjectionC57BL/6 Mouse
check_url/fr/56761?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Lin, T., Liao, Y., Chang, W., Yang, C., Cheng, L., Cheng, M., Cheng, H. The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues. J. Vis. Exp. (136), e56761, doi:10.3791/56761 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image