Establecimiento de un cultivo primario de Sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente
Summary
El siguiente protocolo se centra en el establecimiento de un cultivo primario de sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente (STS). Este modelo podría ayudarnos a entender mejor el fondo molecular y perfil farmacológico de estos raros tumores malignos y podría representar un punto de partida para futuras investigaciones destinadas a mejorar la gestión de STS.
Abstract
Sarcomas de tejidos blandos (STB) representan un espectro de neoplasias heterogéneas con un difícil diagnóstico, clasificación y gestión. Hasta la fecha, se han identificado más de 50 subtipos histológicos de estos raros tumores sólidos. Así, debido a su extraordinaria diversidad y baja incidencia, nuestra comprensión de la biología de estos tumores es todavía limitada. Paciente derivados de culturas representan la plataforma ideal para el estudio de la farmacología y patofisiología de STS. Así desarrollamos un modelo humano de preclínico de STS a partir de muestras tumorales de pacientes sometidos a resección quirúrgica. Paciente derivado STS cultivos celulares fueron obtenidos de los especímenes quirúrgicos por digestión de colagenasa y aislados por filtración. Las células cuentan, semillas y quedaban durante 14 días en cultivos monocapa estándar y luego procesadas por análisis aguas abajo. Antes de realizar el análisis moleculares o la farmacia, el establecimiento de cultivos primarios STS fue confirmado a través de la evaluación de características cytomorphologic y, cuando esté disponible, marcadores immunohistochemical. Este método representa una herramienta útil 1) para estudiar la historia natural de estas neoplasias pobremente explorados y 2) para probar los efectos de diferentes fármacos en un esfuerzo para aprender más sobre sus mecanismos de acción.
Introduction
Sarcomas de tejidos blandos (STB) incluyen un espectro de lesiones heterogéneas de origen mesenquimal representa 1% de todos los tumores sólidos1,2, y la nueva clasificación de la Organización Mundial de la salud reconoce la presencia de más de 50 diferentes subtipos3. Entre estos, los histotypes más comunes son sarcoma del adipocito o liposarcoma y el leiomiosarcoma, representando el 15% y 11% de todos adultos STS, respectivamente4,5. Aunque STS puede desarrollar en diferentes partes del cuerpo, las extremidades y retroperitoneo son los sitios más comunes, que ocurren en el 60% y el 20% de los casos, respectivamente6.
La piedra angular de la terapia para la enfermedad localizada es la resección quirúrgica amplia, mientras que los beneficios de la quimioterapia adyuvante y neoadyuvante aún no están claros y son considerados sólo en casos seleccionados7. En el entorno metastásico, la quimioterapia es el estándar de cuidado pero muestra resultados limitados8. Una mejor comprensión de la biología molecular de STS ayudaría a mejorar el diagnóstico diferencial actual, optimizar los tratamientos disponibles e identificar nuevas dianas para el tratamiento.
En este contexto, se ha realizado investigación en cáncer durante muchos años con líneas de células inmortalizadas9. Estos modelos experimentales normalmente son cultivados en monocapa estándar soporta o implantados en roedores inmunodeficientes para establecer modelos de xenoinjerto en vivo 10. Líneas celulares inmortalizadas representan un material manejable y fácil a las tiendas con las que se puede realizar un amplio número de experimentos de investigación. Son, de hecho, el menos costoso y más ampliamente utilizado herramienta de estudios preclínicos11.
Sin embargo, modelos de línea celular en cáncer también tienen algunas limitaciones, por ejemplo prolongada cultura en un sistema de monocapa junto con un número cada vez mayor de pasajes induce fenotípica y deriva genética, que hace menos probable células recapitular tumor clave características. Por otra parte, cultivos de la línea de celulares no reproducir la interacción célula a célula y señalización interferencia de molécula que imitan el comportamiento biológico de los tumores y caracterizar el microambiente tumoral. Estos temas constituyen la base de la brecha existente entre los resultados preclínicos y clínicos12.
Dado lo anterior, ha aumentado el interés en cultivos primarios derivados del paciente13. De hecho, la supresión del tejido maligno y normal reduce el riesgo de perder el fenotipo de la célula de cáncer y de la heterogeneidad, ofreciendo material de partida que es más representativo del microambiente tumoral. Por otra parte, el uso de muestras de tumor fresco cosechado de pacientes sometidos a resección quirúrgica nos permite investigar los tumores individuales y comparar diversas lesiones de la misma parte del cuerpo de un paciente14. Por las razones expuestas, cultivos de células derivadas de tejido proporcionan un valioso material para estudiar tumor Fisiopatología y Farmacología15,16,17, especialmente en el STB en que líneas de células de sarcoma comercialmente disponibles son limitado18. Así hemos optimizado un método para establecer una cultura de célula primaria de STS paciente derivado a partir de la excisión quirúrgica del tumor tejido13,19,20. Nuestro método consiste en desagregar a la muestra de tumor en los fragmentos pequeños de tejido seguidas por la disociación enzimática de tejido durante la noche para obtener una suspensión unicelular. Al día siguiente, la digestión enzimática se detiene mediante la adición de medio fresco de cultivo y la suspensión obtenida se filtra para remover fragmentos de tejido, agregados de la célula y exceso de matriz material o escombros. Por último, una fracción de las células tumorales aisladas es cytospinned sobre portaobjetos de vidrio, fijos y almacenados para análisis posteriores destinadas a confirmar el establecimiento del cultivo primario STS cytomorphological, immunohistochemical y evaluación citogenética molecular (p. ej. análisis de los pescados de MDM2 amplificación representa el estándar diagnóstico diferencial de un liposarcoma bien diferenciado y liposarcoma dedifferentiated) 4. las células restantes se siembran en una cultura estándar monocapa para estudios farmacológicos y perfiles de expresión génica. Todos los experimentos se realizan con bajos pasajes cultivos primarios para evitar la selección de subclones de cáncer específico y analizan por un patólogo experimentado sarcoma. Así hemos creado un humano STS vivo ex modelo13,19,20. Este versátil, fácil de manija modelo podría representar una herramienta útil para diferentes tipos de investigación preclínica, por ejemplo, para identificar nuevos marcadores moleculares para el diagnóstico y pronóstico o para obtener una comprensión más profunda de la actividad y los mecanismos de acción de estándar y nuevos fármacos utilizados en el tratamiento del STB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos preclínicos bien definidos son necesarios para dilucidar el fondo molecular de tumores, predecir pronóstico pobre y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para pacientes con cáncer. Esto es especialmente importante para los tumores raros como STS cuya alta heterogeneidad en términos de morfología, comportamiento agresivo de la clínico y potencial desafía nuestra comprensión de la biología de STS y tratamiento del paciente21. Por otra parte, las líneas de células de sarcoma…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Gráinne Tierney por asistencia editorial.
Materials
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours – an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294 (2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Recherche en cancérologie. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662 (2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309 (2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).
