En forbedret metode til indsamling af cerebrospinalvæsken fra bedøvede mus
Summary
Denne protokol beskriver en forbedret teknik for rigelige indsamling af cerebrospinalvæske (CSF) med ingen forurening fra blod. Med større prøvetagning og renhed, kan flere analyser udføres ved hjælp af CSF for at fremme vores forståelse af sygdomme, der påvirker hjernen og rygmarven.
Abstract
Cerebrospinalvæske (CSF) er en værdifuld kropsvæske for analyse i neuroscience research. Det er en af væskerne i tætteste kontakt med det centrale nervesystem og dermed kan bruges til at analysere hjernen eller rygmarven syge tilstand uden direkte adgang til disse væv. Dog i mus er det vanskeligt at opnå fra cisterna magna på grund af dets nærhed til blodkar, som ofte forurener prøverne. Området for CSF samling i mus er også vanskeligt at dissekere til og ofte kun små prøver fremstilles (højst 5-7 µL eller mindre). Denne protokol beskriver i detaljer en teknik, der forbedrer på nuværende metoder til indsamling for at minimere forurening fra blodet og give mulighed for rigelig indsamling af CSF (i gennemsnit 10-15 µL kan afhentes). Denne teknik kan anvendes med andre dissektion metoder til indsamling af væv fra mus, da det ikke påvirker nogen væv under CSF udvinding. Således, hjernen og rygmarven påvirkes ikke med denne teknik og forblive intakt. Med større CSF prøvetagning og renhed, flere analyser kan bruges med denne væske til yderligere støtte neurovidenskab forskning og bedre forståelse af sygdomme, som rammer hjernen og rygmarven.
Introduction
CSF er en værdifuld kropsvæske for analyse i neuroscience research. CSF er primært fremstillet af blodplasma, som indeholder få celler (ingen røde blodlegemer og kun et par hvide blodlegemer) og er næsten protein-fri. Det er en af væskerne i tæt kontakt med det centrale nervesystem (CNS) og det kan passere mange elektrolytter fra hjerne og rygmarv til det perifere system. Hos mennesker, CSF prøver kan blive indsamlet til støtte i diagnosticering af sygdom eller til forskningsformål i kliniske forsøg, som en rygmarvsprøve (eller lumbalpunktur) er en mindre invasiv procedure: CSF væske kan afspejle ændringer i CNS uden at have direkte adgang til disse væv. I de seneste år, til forskningsformål i klinikken, fremstillet CSF prøver således af patienter i neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom og andre demenssygdomme1,2,3. Der er mange biomarkør assays, som er blevet udviklet ved hjælp af CSF prøver at potentielt støtte i diagnosticering af sygdomme i klinikken2,3. Men der er meget debat om pålideligheden af disse assays til at producere konsekvent, følsomme resultater for at specifikt diagnosticere sygdommen4,5. Så er der et stort behov for udvikling af bedre assays og mål, som kan findes i EFSR’EN, at støtte i at fremstille en standard teknik til at diagnosticere neurodegenerative sygdomme med større følsomhed og specificitet. På grund af den potentielle betydning af menneskelige CSF prøver i sygdom er samlingen af CSF fra gnavere i neurovidenskab forskning også af interesse.
Mus er vigtigt dyr i biologiske og medicinske forskning og mulighed for afprøvning af potentielle terapeutiske forbindelser og proof-of-concept undersøgelser før humane kliniske forsøg. Men i mus, det er svært at få CSF prøver på grund af dets nærhed til hjernen i et lille dyr, som den sædvanlige metode af CSF samling i mus er at få det via cisterna magna, en åbning mellem cerebellum og dorsale flade af medulla oblongata. Dette medfører vanskeligheder i indsamling af CSF prøver som dette område er svært at dissekere til og i umiddelbar nærhed af blodkar, øger risikoen for kontaminering fra blodlegemer. På grund af disse vanskeligheder, de fleste forskere kan kun få en lille mængde af CSF for analyse (normalt angivet som 5-7 µL) og kontaminering af CSF prøver af blod celler er en primær bekymring for analyser6,7,8 , 9. blod kontaminering kan overskygge resultaterne og ikke virkelig afspejler tilstanden af CNS. Desuden begrænset prøve indsamles kan påvirke forskning som det sædvanlige beløb indsamlet fra mus er nok kun én måling (i to eller tre eksemplarer) ved hjælp af enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA). Således er CSF prøver normalt samles fra flere mus for at have nok prøve at køre flere assays. Udvikle en protokol til den rigelige, uforurenet samling af CSF fra mus ønskes høj grad og vil være en fordel i at forbedre neurovidenskab forskning ved hjælp af gnavere.
I denne protokol, en teknik til den rigelige (et gennemsnit på 10-15 µL) samling af CSF fra bedøvede mus er beskrevet i detaljer og forbedrer på et aktuelt kendte metode til CSF samling at minimere forurening fra blod10. Et robust protokol for CSF samling vil støtte i udviklingen af CSF-baserede biomarkør assays, som kunne bruges til at støtte i diagnosticering af sygdomme, samt forbedre forskningen i de mekanismer, der ligger til grund for sygdomme, der rammer CNS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver i detaljer en teknik, der forbedrer den nuværende metoder10 af CSF samling at minimere forurening fra blod og den rigelige samling af CSF (gennemsnitligt ~ 10-15 µL kan opnås) fra mus. Når bryde den kapillære tip, spidsen af kapillar bør ikke være for lille (som dengang CSF vil være uddraget meget langsomt) eller for stor (vil ikke blive fint nok til at indsamle EFSR’EN og væv kan blive indgivet i kapillar). Bør udvises forsigtighed ved dissekere område for CSF …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81650110527, 81371400) og nationale nøglen grundlæggende forskning Program af Kina (2013CB530900).
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer’s Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer’s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer’s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer’s Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer’s disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer’s Dement. , (2016).
- You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
