Dissektion og farvning af Drosophila puppe æggestokke
Summary
Drosophila æggestokken er en fremragende modelsystem til at undersøge stamceller niche udvikling. Om metoder til dissekere larve og voksen æggestokke er blevet offentliggjort, kræver puppe æggestokken dissektioner forskellige teknikker, der ikke er blevet offentliggjort i detaljer. Her skitsere vi en protokol til dissekere, farvning og montering puppe æggestokke.
Abstract
I modsætning til voksne Drosophila æggestokke, puppe æggestokkene er relativt vanskeligt at få adgang til og undersøge på grund af deres lille størrelse, translucence og omslutter inden en puppe sagen. Udfordringen at dissekere puppe æggestokkene ligger også i deres fysiske placering i puppe: æggestokkene er omgivet af fedt kroppens celler inde i puppe maven, og disse fedtceller skal fjernes for at give mulighed for korrekt antistoffarvning. For at overvinde disse udfordringer, udnytter denne protokol tilpassede Pasteur pipets hen til uddrag fedt kroppens celler fra puppe maven. Desuden, en chambered daekglas er brugt i stedet for et microcentrifuge rør under farvning processen for at forbedre synligheden af pupper. Men trods disse og andre fordele af de værktøjer, der anvendes i denne protokol, vellykket gennemførelse af disse teknikker kan stadig indebære flere dage i praksis på grund af den lille størrelse af puppe æggestokke. De teknikker, der er skitseret i denne protokol kunne anvendes til tid kursus eksperimenter, hvor æggestokkene er analyseret i forskellige faser af pupal udvikling.
Introduction
Forskning i stamceller ved hjælp af Drosophila æggestokke har meget udvidet siden den første dokumentation af en stamcelle niche1,2,3,4. Efter udviklingen af afstamning sporingen genetiske værktøjer, Drosophila æggestokken dissektioner har været almindeligt anvendt til at undersøge stamceller lineages og signalering veje, der regulerer stamcelle vedligeholdelse, spredning og skæbne i stamceller niche. Kendskab til disse signaling veje kan give indsigt i potentielle årsager til kræft, der stammer fra afvigende stamcelle aktivitet5,6,7. Det har også for nylig blevet vist, at somatiske stamceller i Drosophila æggestokken, kendt som follikel stamceller (FSCs), stærkt ligner mammale tarm stamceller i mange aspekter af deres organisation8. Af denne grund er Drosophila æggestokkene en meget nyttig modelsystem til at undersøge stamceller adfærd.
Mens larve og voksen æggestokkene tilbyder spor til tidlig udvikling af stamceller og sidste stamcelle organisation i niche, henholdsvis, er puppe æggestokken en mellemliggende struktur, hvor kønscelleoverførsel og somatiske celler omorganisere og etablere deres identiteter 9 , 10. selvom adskillige studier har undersøgt aspekter af væv udviklingen i puppe æggestokken10,11,12,13, stadig spørgsmål om differentiering og rumlige organisation af æggestokkene celletyper under puppe udvikling. Navnlig, opstår specifikation af FSCs i denne periode. Denne protokol beskriver en metode til at dissekere og farvning puppe æggestokkene på ønskede tidspunkter – en teknik, der kan bruges i gang kursus eksperimenter, at analysere puppe æggestokken udvikling i detaljer fra den larve til det voksne Stadium.
For at tage højde for den lille størrelse, translucence og utilgængelighed i puppe æggestokkene inden for puppe maven, denne protokol benytter værktøjer såsom en custom-made tynd spids Pasteur pipette til at fjerne abdominal fedt kropsvæv blokerer antistof adgang til den æggestokkene. En klar, chambered daekglas anvendes under antistof farvning tilbyder større synlighed af pupper og en blidere platform for vuggende æggestokkene på en “Nutator.” Baseret på en protokol for larver æggestokken dissektioner af Maimon og Gilboas14, en relativt høj koncentration af Triton X-100 har været ansat i de indledende trin i proceduren farvning at maksimere cellemembranen permeabilization og antistof adgang til den æggestokkene celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest vigtige og vanskelige skridt af denne protokol omfatter forberedelse af puppe æggestokke før fiksering. For at sikre, at æggestokkene, små og begravet af fedt kroppens celler inde i puppe maven, farves tilstrækkeligt med antistoffer, er det vigtigt at ikke kun rive en stor åbning i den abdominal sæk med pincet, men også ekstrakt fedt kroppens celler, der hæmmer den æggestokkene fra antistoffer. Vellykket gennemførelse af dette trin kræver anvendelsen af subtil pres på Pasteur afpipetteres pære mens…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health (RO1 GM079351 til D.K.). Vi takker Dorothea Godt for hendes nyttige råd om puppe æggestokken dissektioner baseret på hendes oprindelige protokol. Vi takker også Amy Reilein for hendes hjælp og kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Génétique. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
