Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal
Summary
L’ovaire de la drosophile est un système excellent modèle pour étudier le développement de niche de cellules souches. Bien que les méthodes pour disséquer les ovaires larvaires et adultes ont été publiées, les dissections ovaires nymphales exigent d’autres techniques qui n’ont pas été publiées en détail. Ici, nous exposons un protocole de dissection, coloration et montage des ovaires nymphales.
Abstract
Contrairement aux ovaires de drosophile adultes, ovaires nymphales sont relativement difficiles d’accès et examiner en raison de leur petite taille, la translucidité et moulant au sein de la pupe. Le défi de disséquer les ovaires nymphales réside aussi dans leur emplacement physique au sein de la chrysalide : les ovaires sont entourées par des cellules de corps gras à l’intérieur de l’abdomen pupal, et ces cellules adipeuses doivent être enlevés pour permettre une bonne anticorps. Pour surmonter ces défis, ce protocole utilise des pipettes Pasteur personnalisés afin d’extraire les cellules du tissu adipeux de l’abdomen pupal. En outre, une lamelle compartimentée est utilisée à la place d’un tube de microcentrifuge pendant le processus de coloration pour améliorer la visibilité de la pupe. Cependant, malgré ces et d’autres avantages des outils utilisés dans le présent protocole, l’exécution réussie de ces techniques peut nécessiter encore plusieurs jours de pratique en raison de la petite taille des ovaires nymphales. Les techniques décrites dans le présent protocole pourraient être appliquées à des expériences de cours moment où ovaires sont analysés à différents stades de développement de pupe.
Introduction
Recherche sur les cellules souches utilisant drosophile ovaires a largement augmenté depuis la première documentation d’une cellule souche niche1,2,3,4. Suit l’évolution des outils génétiques du traçage de lignage, drosophile ovaire dissections ont été couramment utilisées pour étudier des lignées de cellules souches et les voies qui régulent la maintenance des cellules souches, la prolifération et sort dans la niche de cellules souches de signalisation. Connaissance de ces voies de signalisation peut-être donner un aperçu des causes possibles des cancers qui proviennent des cellules souches aberrantes activité5,6,7. Il a récemment été démontré que les cellules souches somatiques dans l’ovaire de la drosophile , appelées cellules souches de follicule (FSC), ressemblent fortement aux mammifères les cellules souches intestinales dans de nombreux aspects de leur organisation8. Pour cette raison, les ovaires de drosophile sont un système modèle hautement utile pour étudier le comportement des cellules souches.
Alors que les ovaires larvaires et adultes offrent des indices de développement précoce de cellules souches et l’organisation de la finale des cellules souches dans la niche, respectivement, l’ovaire pupal est une structure intermédiaire, dans lequel les cellules germinales et les cellules somatiques réorganiser et d’établir leur identité 9 , 10. bien que plusieurs études ont examiné des aspects du développement des tissus dans l’ovaire pupal10,11,12,13, questions subsistent quant à la différenciation et l’organisation spatiale des types de cellules ovariennes au cours du développement de pupe. En particulier, la spécification du FSC se produit pendant cette période. Ce protocole décrit une méthode de dissection et coloration des pupes ovaires aux moments désirés — une technique qui peut être utilisée dans des expériences de cours temps qui analysent le développement de pupes ovarien en détail de du stade larvaire au stade adulte.
Pour expliquer la petite taille, translucidité et inaccessibilité de l’ovaire pupe dans l’abdomen de pupe, ce protocole utilise des outils tels qu’une pipette de Pasteur à pointe fine sur mesure pour enlever le tissu adipeux abdominal entrave l’accès d’anticorps à la ovaires. Une lamelle de claire, chambrée utilisée au cours de l’anticorps coloration offre une plus grande visibilité de la pupe et une plateforme plus douce balancement des ovaires sur un « Nutator ». Basé sur un protocole pour les dissections de larves ovaire de Maimon et Gilboa14, une concentration relativement élevée de Triton X-100 a été utilisée dans les premières étapes de la procédure de marquage pour maximiser l’accès perméabilisation et anticorps de membrane cellulaire à la cellules ovariennes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étape la plus critique et difficile du présent protocole nécessite la préparation des pupes ovaires avant la fixation. Pour s’assurer que les ovaires, petits et enterrées par les cellules de corps gras à l’intérieur de l’abdomen pupal, sont suffisamment colorées avec les anticorps, il est important de larme non seulement une grande ouverture dans le sac abdominale avec une pince, mais aussi extraire les cellules de corps gras qui obstruent les ovaires de l’anticorps. L’exécution réussie de cette ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par les National Institutes of Health (GM079351 RO1 à D.K.). Nous remercions Dorothea Godt pour ses conseils utiles sur des dissections ovaire pupal basé sur son protocole original. Nous remercions également Amy Reilein pour son aide et les commentaires sur le manuscrit.
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Génétique. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
