Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila
Summary
L’ovaio di Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare lo sviluppo di nicchia delle cellule staminali. Anche se i metodi per la dissezione ovaie larvale e adulte sono stati pubblicati, le dissezioni pupal ovaia richiedono tecniche differenti che non sono stati pubblicati in dettaglio. Qui descriviamo un protocollo per la dissezione, colorazione e montaggio pupale ovaie.
Abstract
A differenza di adulto Drosophila ovaie, pupale ovaie sono relativamente difficili da accedere ed esaminare a causa della loro piccola dimensione, traslucenza e che incassa all’interno di un caso pupal. La sfida di dissezione pupale ovaie si trova anche nella loro posizione fisica all’interno della pupa: le ovaie sono circondate dalle cellule di grasso corporeo all’interno dell’addome pupal, e queste cellule di grasso deve essere rimosso per consentire la macchiatura dell’anticorpo appropriato. Per superare queste sfide, questo protocollo utilizza personalizzate pipette Pasteur per estrarre le cellule del corpo di grasso dall’addome pupal. Inoltre, un coprioggetto chambered viene utilizzato al posto di un tubo del microcentrifuge durante il processo di colorazione per migliorare la visibilità delle pupe. Tuttavia, nonostante questi ed altri vantaggi degli strumenti utilizzati nel presente protocollo, corretta esecuzione di queste tecniche può coinvolgere ancora diversi giorni di pratica a causa delle piccole dimensioni delle ovaie pupale. Le tecniche descritte in questo protocollo potrebbero essere applicate agli esperimenti di corso di tempo in cui le ovaie sono analizzate nelle varie fasi di sviluppo pupa.
Introduction
Ricerca sulle cellule staminali utilizzando Drosophila ovaie è ampiamente sviluppato dalla prima documentazione di una cellula staminale nicchia1,2,3,4. Seguendo lo sviluppo di strumenti genetici di lignaggio traccia, ovaio di Drosophila dissezioni sono stati comunemente utilizzate per lo studio di cellule staminali lignaggi e vie che regolano il mantenimento delle cellule staminali, proliferazione e destino nella nicchia delle cellule staminali di segnalazione. Conoscenza di queste vie di segnalazione può produrre intuizioni potenziali cause di tumori che hanno origine da cellule staminali aberrante attività5,6,7. Inoltre recentemente è stato dimostrato che le cellule staminali somatiche nell’ovaio di Drosophila , conosciuto come le cellule staminali del follicolo (FSCs), fortemente assomigliano cellule staminali intestinale dei mammiferi in molti aspetti della loro organizzazione8. Per questo motivo, Drosophila ovaie sono un sistema di modello altamente utile per studiare il comportamento delle cellule staminali.
Mentre le ovaie larvale e adulte offrono indizi per lo sviluppo iniziale della cellula formativa e l’organizzazione finale della cellula formativa nella nicchia, rispettivamente, l’ovaio pupal è una struttura intermedia in cui la linea germinale e cellule somatiche riorganizzare e stabilire la loro identità 9 , 10. anche se parecchi studi hanno esaminato gli aspetti dello sviluppo del tessuto nell’ovaia pupal10,11,12,13, domande rimangono per quanto riguarda la differenziazione e l’organizzazione spaziale di tipi di cellule ovariche durante lo sviluppo pupa. In particolare, la specifica del FSCs si verifica durante questo periodo. Questo protocollo descrive un metodo per la dissezione e la macchiatura pupale ovaie a intervalli di tempo desiderato — una tecnica che può essere utilizzata in esperimenti di corso di tempo che analizzano lo sviluppo pupale ovaia in dettaglio dalla larvale alla fase adulta.
Per tenere conto le piccole dimensioni, traslucenza e inaccessibilità dell’ovaia pupal all’interno dell’addome pupal, questo protocollo utilizza strumenti come una pipetta di Pasteur su misura con la punta sottile per rimuovere il tessuto addominale grasso corporeo che ostruisce l’accesso dell’anticorpo per il ovaie. Un coprioggetto chiaro, chambered utilizzato durante l’anticorpo che macchia offre una maggiore visibilità delle pupe e una piattaforma più delicata per oscillare le ovaie su un “Nutator”. Basato su un protocollo per le dissezioni dell’ovaia larvale di Maimon e Gilboa14, una concentrazione relativamente alta di Triton X-100 è stata impiegata nelle fasi iniziali della procedura di colorazione per massimizzare l’accesso di permeabilizzazione e anticorpo di membrana cellulare per il cellule ovariche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il passo più critico e difficile di questo protocollo prevede la preparazione delle ovaie pupale prima della fissazione. Per garantire che le ovaie, piccole e sepolte dalle cellule di grasso corporeo all’interno dell’addome pupal, sono macchiate sufficientemente con gli anticorpi, è importante non solo strappare una grande apertura nel sacco addominale con il forcipe, ma anche estrarre le cellule di grasso corporeo che ostacolano la ovaie dagli anticorpi. Corretta esecuzione di questo passaggio richiede l’applicazione …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (RO1 GM079351 di D.K.). Ringraziamo Dorothea Godt per i suoi consigli utili su dissezioni dell’ovaia pupal basato sul suo protocollo originale. Ringraziamo anche Amy Reilein per la sua assistenza e commenti sul manoscritto.
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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