郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損
Summary
ショウジョウバエ卵巣は、幹細胞ニッチの開発を研究するためのエクセレント モデル システムです。幼虫及び成虫の卵巣を解剖するための方法を公開されている、蛹卵巣解剖詳しく公開されていない別のテクニックが必要です。ここでは、解離性、染色、および蛹卵巣をマウントするためのプロトコルを概説します。
Abstract
大人のショウジョウバエ卵巣とは異なり蛹卵巣は比較的アクセスし、彼らの小型のため確認することは困難、サイズ、半透明、蛹のケース内で被覆。蛹卵巣の解剖の課題はまた蛹内の物理的な場所にある: 卵巣蛹腹部内脂肪体細胞に囲まれているし、これらの脂肪細胞は適切な抗体の汚損のため許可を削除必要があります。これらの課題を克服するためには、このプロトコルは、蛹の腹部からの脂肪体細胞を抽出するためのカスタマイズされたパスツール pipets を利用しています。また、蛹の可視性を改善するために染色のプロセス中に、カバーグラスチェンバーを遠心管の代わりに使用します。ただし、これらとこのプロトコルで使用するツールの他の利点にもかかわらず、これらの技術の実行が成功は、まだ蛹卵巣のサイズが小さいため練習のいくつかの日を伴うことがあります。このプロトコルに記載されているテクニックは、蛹の開発のさまざまな段階で卵巣を解析時間コース実験に適用でした。
Introduction
ショウジョウバエの卵巣を用いた幹細胞研究は、幹細胞ニッチ1,2,3,4の最初のドキュメンテーションから広く展開しています。リネージュ トレース遺伝的ツール、解剖がよく幹細胞を研究に使用されているショウジョウバエ卵巣の開発と幹細胞維持、増殖、および幹細胞ニッチの運命を制御するシグナルします。これらのシグナル伝達経路の知識は、異常な幹細胞活動5,6,7から由来する癌の潜在的な原因への洞察力をもたらす可能性があります。また、最近、卵胞幹細胞 (Fsc)、として知られているショウジョウバエ卵巣の体性幹細胞、彼らの組織の8の多くの側面で哺乳類の腸管幹細胞のように強く示されています。このため、ショウジョウバエ卵巣が幹細胞の挙動を研究するための非常に有用なモデル システムです。
幼虫及び成虫の卵巣はそれぞれ初期の幹細胞の開発とニッチで最終的な幹細胞組織への手がかりを提供、蛹卵巣は生殖細胞と体細胞で再編成、彼らのアイデンティティを確立中間構造9,10. 分化と空間構成に関する質問のままいくつかの研究は、蛹卵巣10、11,12,13組織開発の側面を検討しているが蛹の発育中の卵巣細胞型。特に、Fsc の仕様は、この期間中に発生します。このプロトコルの概要を解剖の目的の時点で蛹卵巣染色法-蛹卵巣における大人の段階に幼虫から詳細を分析時間コース実験で使用できるテクニック。
小型、半透明、蛹卵巣蛹腹部内の到達不能にする、このプロトコルは抗体アクセスを妨げる腹部脂肪体組織を除去するカスタムメイドの薄い先端パスツール ピペットなどのツールを利用して、卵巣。蛹の”Nutator”の卵巣を揺動の穏やかなプラットフォームを提供しています高い視認性を汚す抗体中に使用される明確なチェンバード coverglassMaimon、ギルボア14による幼虫卵巣の解剖のプロトコルに基づいて、トリトン X-100 の比較的高い濃度で採用されている染色の手順の最初の手順に細胞膜透過と抗体アクセスを最大化する、卵巣細胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの最も重要かつ困難なステップには、固定する前に蛹卵巣の準備が含まれます。抗体と、卵巣、小さくて蛹腹部内脂肪体細胞によって埋められること十分に汚れることを確認、鉗子、腹部の袋に大きな開口部を引き裂くだけでなくが、また妨げる脂肪体細胞を抽出することが重要です、抗体からの卵巣。この手順が正常に実行が必要です腹部の袋から脂肪体細胞を洗いながら?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所によって支えられた (d. k. に GM079351 RO1)。ドロテア Godt に彼女の元のプロトコルに基づいて蛹卵巣の解剖に彼女の有用なアドバイスありがちましょう。我々 はまた、彼女の援助と原稿のコメントをエイミー Reilein を感謝します。
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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