Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama
Summary
Drosophila yumurtalık kök hücre niş geliştirme eğitim için mükemmel model bir sistemdir. Larva ve yetişkin yumurtalık dissekan için yöntemleri yayımlanmış olsa, Pupa yumurtalık diseksiyonlarının ayrıntılı olarak yayınlanmamıştır farklı teknikler gerektirir. Burada diseksiyon, boyama ve pupa yumurtalık montaj için bir protokol anahat.
Abstract
Yetişkin Drosophila yumurtalık, Pupa yumurtalık erişmek ve onların küçük nedeniyle incelemek nispeten zor olan boyut, translucence ve bir pupa dava içinde kapatan. Pupa yumurtalık dissekan meydan aynı zamanda fiziksel konumlarını pupa içinde yatıyor: yumurtalık içinde pupa karın yağ vücut hücreleri tarafından çevrilidir ve bu yağ hücrelerinin doğru antikor boyama için izin vermek için kaldırılması gerekir. Bu zorlukları aşmak için pupa karından yağ vücut hücreleri ayıklamak için özelleştirilmiş Pasteur pipets bu protokolü kullanır. Ayrıca, Pupa görünürlüğünü artırmak için odacıklı bir coverglass yerine microcentrifuge tüp boyama işlemi sırasında kullanılır. Ancak, bu ve diğer avantajları bu protokol için kullanılan araçlar rağmen bu tekniklerin başarılı yürütme hala pratik pupa yumurtalık küçük boyutu nedeniyle birkaç gün içerebilir. Bu protokol için özetlenen teknikleri yumurtalık çeşitli yaşlardaki pupa analiz edilir zaman ders deneyler için uygulanabilir.
Introduction
Drosophila yumurtalık kullanarak kök hücre araştırma kök hücre niş1,2,3,4ilk belgelenmesi beri yaygın olarak genişletti. Soy izleme genetik araçlarını, Drosophila yumurtalık diseksiyonlarının sık kök hücre soy eğitim için kullanılan gelişimi takip ve kök hücre bakım, yayılmasını önleme ve kök hücre niş kadere düzenleyen yolları sinyal. Bu sinyal yolları bilgisine kanserlerin anormal kök hücre etkinlik5,6,7‘ den kaynaklanan olası nedenler anlayışlar verim. Ayrıca son zamanlarda folikül kök hücreler (FSCs) bilinen Drosophila yumurtalık somatik kök hücre şiddetle memeli bağırsak kök hücre kendi organizasyon8birçok yönleriyle benzer gösterilmiştir. Bu nedenle, Drosophila yumurtalık kök hücre davranış eğitimi için son derece faydalı model sistemi vardır.
Larva ve yetişkin yumurtalık erken kök hücre gelişimi ve niş içinde son kök hücre organizasyon ipuçları sırasıyla sunarken, Pupa yumurtalık germline ve somatik hücre yeniden düzenlemek ve kimliklerini kurmak bir ara yapıdır 9 , 10. rağmen birçok araştırma yönleri pupa yumurtalık10,11,12,13‘ te doku gelişimi inceledik, farklılaşma ve mekansal organizasyonu ile ilgili sorular kalır pupa geliştirme sırasında yumurtalık hücre türleri. Özellikle, bu döneminde FSCs tayini oluşur. Bu iletişim kuralı anatomi ve istediğiniz zaman noktalarda pupa yumurtalık boyama yöntemi özetliyor — pupa yumurtalık gelişimi yetişkin sahneye larva üzerinden ayrıntılı olarak analiz zaman ders deneylerde kullanılan bir teknik.
Küçük boyutu, translucence ve pupa karın içinde pupa yumurtalık erişilememesi için hesap için bu iletişim kuralını antikor erişimin engellenmesi karın yağ vücut dokusu kaldırmak için bir ısmarlama ince uçlu Pasteur damlalıklı gibi araçlar kullanır Yumurtalık. Teklifler geniş çaplı bir görünürlük pupa ve yumurtalık “Nutator” üzerinde sallanan nazik bir platform boyama antikor sırasında kullanılan bir açık, odacıklı coverglass Larva yumurtalık gruptakiler için bir protokol Maimon ve beratını14tarafından dayanarak, Triton X-100 nispeten yüksek bir konsantrasyon boyama yordamın ilk adımda hücre zarının permeabilization ve antikor erişimin en üst düzeye çıkarmak için istihdam edilmiştir Yumurtalık hücreleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralının en kritik ve zor adım pupa yumurtalık fiksasyon öncesinde hazırlanması içerir. Yumurtalıklar, küçük ve gömülü içinde pupa karın yağ vücut hücreleri tarafından yeterince antikorlar ile lekeli emin olmak için sadece büyük bir açılış karın yatakta Forseps ile gözyaşı ama aynı zamanda engel yağ vücut hücreleri ayıklamak önemlidir Yumurtalık antikorlar üzerinden. Bu adımın başarılı yürütme gerektirir yağ vücut hücrelerinin karın çuval dışarı yıkama…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (RO1 GM079351 D.K. için). Dorothea Godt onun orijinal protokolüne dayanan pupa yumurtalık diseksiyonu yararlı onun tavsiye için teşekkür ediyoruz. Biz ayrıca Amy Reilein ona yardım ve el yazması üzerine yorum için teşekkür ederiz.
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Génétique. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
