Zika 病毒特定诊断表位发现
Summary
在本协议中, 我们描述了一种利用高密度肽芯片来发现 Zika 病毒特异性诊断肽的技术。该议定书可 readly 其他新出现的传染性疾病。
Abstract
高密度肽微阵列允许在一张标准显微镜幻灯片上筛选超过6000多肽。该方法可应用于药物的发现、治疗目标的识别和诊断的发展。在这里, 我们提出了一个协议, 以发现特定的 Zika 病毒 (ZIKV) 诊断肽使用高密度肽芯片。用一种高密度肽微阵列对 ZIKV 感染进行了验证, 该芯片含有将整个 ZIKV 蛋白转化为3423个独特的15线性氨基酸 (aa) 残留物, 并重复打印 14 aa 的残留重叠。在同一阵列内染色不同的二次抗体, 我们检测到与血清中存在的免疫球蛋白 M (IgM) 和免疫球蛋白 G (IgG) 抗体结合的肽。选择这些肽进行进一步的验证实验。在本协议中, 我们描述了在设计、处理和分析高密度肽芯片时所采用的策略。
Introduction
基于临床症状的 Zika 病毒 (ZIKV) 诊断具有挑战性, 因为它与登革热和基孔肯亚病毒感染的传播媒介、地理分布和症状有关1。鉴于怀孕期间感染 ZIKV 的妇女面临不良妊娠结局的风险, 区分3病毒是很重要的。虽然目前的分子诊断测试是特定的, 但它们只在血液或唾液中有用, 在相对较短的急性感染期间2,3。血清学检测是诊断这一初始感染期以外的重要4。
ZIKV 特异性血清学检测的发展具有挑战性的两个原因: 一是人类免疫系统反应的 Zika 抗原目前尚不为人所知;第二, 保守的 flaviviruses 氨基酸序列诱导抗体的交叉反应性。我们的目的是发现独特的 ZIKV 特定肽用于诊断。已经开发出不同的方法来筛选包括噬菌体、细菌和酵母表面在内的整个蛋白质的肽库, 显示5,6,7,8,9, 10。我们的战略是使用高密度肽芯片, 允许快速和廉价的高通量血清学筛查11,12 , 随后确定的肽可用于改善目前的血清学检测 ZIKV 感染的方法。
此协议允许使用高密度肽芯片 (图 1) 发现 Zika 病毒特定诊断肽。采用多肽激光印花技术制备高密度肽微阵列。整个 ZIKV 蛋白序列由3423种基于法国玻利尼西亚应变 (基因库: KJ776791.2) 的氨基酸残留物印在标准玻璃上, 在15条线性残留物块中, 重叠14个氨基酸残留物, 以复制共6846个肽斑。除了整个 Zika 蛋白序列多肽, 微阵列利用流感血凝素 (HA) 肽进行内部控制.
Zika 证实的阳性血清样本 (纽约州奥尔巴尼) 获得, 用于鉴定特定的免疫球蛋白 M (IgM) 和免疫球蛋白 G (IgG) 活性肽。在一夜之间用样本孵化后, 微阵列被染成二级 fluorochrome 共轭抗体 (抗人 IgM 或抗人 IgG), 并在微阵列扫描仪上进行分析。用制造芯片的同一公司提供的特定软件对光斑强度和肽标注进行量化。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们设计了一个协议, 利用高密度肽芯片包含整个 Zika 病毒蛋白序列 (法国玻利尼西亚人菌株)。该芯片是通过打印3423不同的重叠线性多肽制造的。每一个肽是15氨基酸并且由它的最近的邻居仅一个残余在序列 (例如, 14 残余重叠) 变化。虽然可以打印较短的重叠, 但表位映射更精确, 重叠时间更长。每一个肽都以重复打印, 以提高可靠性。
重要的是开始的过程中, 预先染色?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
目前的支持由 NIDCRR44 DE024456 的 SBIR (小型企业创新研究) 行政补充补助金提供。NIDCR 艾滋病毒补助金的发展 NIDCR 赠款 U01 DE017855, 以制定一个验证性的护理点诊断艾滋病毒。我们感谢 Silke Weisenburger (德国海德堡 PEPperPRINT) 的技术援助和亲切支持。我们还感谢纽约大学朗格尼医学中心的李-林奥德赛成像系统。
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue’s cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
- Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the “Immunosignaturing Effect”. Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
