Burada, mekanik çalışma içinde in vitro ve in vivoiçin bir besleyici-Alerjik farklılaşma sistemi kullanılarak gen susturmak fare NK hücreleri toplu üretim için bir protokol mevcut.
Doğal öldürücü (NK) hücreleri doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait olan ve ilk satır anti-kanser bağışıklık savunma; Ancak, tümör microenvironment görüntülenmez ve altta yatan mekanizma hala büyük ölçüde bilinmiyor. NK hücre tutarlı ve güvenilir bir kaynak eksikliği NK hücre dokunulmazlık araştırma ilerlemesini sınırlar. Burada, yüksek kalite ve kemik iliği türevi fare NK hücreleri besleyici-Alerjik bir koşulda miktarı sağlayabilir bir vitro sistem raporu. Daha da önemlisi, biz da siRNA aracılı gen susturmak başarıyla E4bp4 bağımlı NK hücre olgunlaşma bu sistemi kullanarak engeller olduğunu göstermektedir. Böylece, sistem ayırt bu roman vitro NK hücre dokunulmazlık araştırma için bir biomaterial çözümdür.
Kanser ilerleme dahil olmak üzere ana bilgisayar kaynaklı immunocytes, örneğin, NK hücreleri tümör microenvironment1,2‘ de, büyük ölçüde bağlıdır. Çeşitli çalışmalar intratumoral NK hücreleri ile tümör ilerleme3,4olumsuz correlated gösterdi. Buna ek olarak, klinik çalışmalar NK hücre evlat edinen tedavisi kanser5,6,7,8,9için olası bir strateji olduğunu gösterdi. NK hücre tabanlı kanserli hastalarda son zamanlarda solid tümör için bir tedavi seçeneği olarak önerildi ama immünsüpresif sitokinler salgılanmasını ve downregülasyon ligandlar solid tümör microenvironment içinde etkinleştirme nedeniyle sorunlar yok 10,11. Dönüştürme büyüme faktörü-β (TGF-β) karsinojenezis içinde baskılayıcı bir rol oynamaya önermek, ama garip bir şekilde kanser hücrelerinin da tümör gelişimi12,13,14 desteklemek için TGF-β1 üretmek , 15. TGF-β sinyal NK hücreleri aşağı düzenleyen interferon responsiveness ve CD16 aracılı interferon-gamma (IFN-γ) üretim vitro16,17, via cytolytic faaliyet bastırmak 18.
TGF-β tümör microenvironment sinyal kesintileri kanserleri ortadan kaldırmak için olası bir yol olabilir, ancak tamamen TGF-β sinyal engelleme anti-inflamatuar fonksiyonu, nedeniyle otoimmün hastalıklar gelişimi tarafından kanıtlanan neden olur olumsuz yan etkileri sistemik inflamasyon da dahil olmak üzere, kardiyovasküler kusur ve otoimmünite Mouse modelleri19. Böylece, TGF-β-aracılı immünosupresyon çalışma mekanizması anlama kanser tedavisi için erişilebilir bir terapötik hedef tanımlaması sağlayacaktır.
NK hücre gelişimi için gerekli moleküler olayları aydınlatmak için fare kemik iliği hematopoetik kök hücreler NK içine ayırt20hücreleri için Williams ve ark. bir vitro sistemi kurdu. Bu sistem mekanik çalışma kimliği roman ataları NK hücreleri21de dahil olmak üzere NK hücre gelişimi büyük ölçüde kolaylaştırır. Ancak, kemik iliği ataları OP9 stromal hücreler bir besleyici katman20,21destekleyici sistemdeki kültürlü ve bu türdeş olmayan hücre nüfus büyük ölçüde gen engellemeden, daha fazla uygulama sınırları araçları (örneğin, gen siRNA aracılı susturmak) ayırt NK hücreleri için özel olarak uygulanan.
Burada, daha fazla Williams ve ark20de vitro sistemi değiştirerek geliştirilmiştir besleyici-free sistemi açıklanmaktadır. Sistemimizde, OP9 stromal besleyici hücreler gerekli değildir, ve bunun yerine Koşullu orta NK hücreleri vitrove bu farklılaşma son zamanlarda etkilemeden kullanılır OP9 bizi TGF-β kanser ilerlemesi yoluyla teşvik yapabiliyor ortaya çıkarmak için tümör microenvironment22E4bp4 bağımlı NK hücre gelişimi bastırmak. Bu yeni sistem başarıyla NK hücre gelişimi belirli koşullar altında moleküler mekanizması elucidating bir ücretsiz arka plan yöntem sağlar (örneğin, yüksek TGF-β1, gen siRNA aracılı susturmak, vs.) vitro.
Mevcut çalışma, kemik iliği türevi fare NK hücreleri içinde vitroüretimi için yeni bir yöntem anlatmıştık. Özgün sistem21,22 cep besleyiciye başarıyla büyük ölçüde daha farklılaşma sistem istikrarlı OP9 hücreleri koşullu medyum tarafından değiştirilir. Buna ek olarak, sistem yüksek miktar üretebilir ve olgun NK saflığı vitro hem de in vivo hücre deneyleri, mekanik çalışma gibi insan hastalıkları …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada araştırma hibe Konseyi, Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) ve yenilik ve Hong Kong Teknoloji Fonu (Its/227/15, Its INP/164/16 Its-INP/242/16), doğrudan hibe tarafından araştırma-CUHK (2016.035) ve Hong Kong bilim adamı desteklenmiştir Program.
H.-yl tasarlanmış ve tüm deneylerin denetimli ve el yazması hazırlanması için katkıda bulunmuştur. Saatleri arasında-K.T. gerçekleştirilen deneyler, veri analiz ve el yazması hazırlanması için katkıda bulunmuştur. PC-T. T., J.Y.-F.C., js-C., H., s.-M.W., ve G.-yl hayvan numuneleri ve hayvan deneylerinde katıldı. Js, X.-R.H., ve K.-F.T. el yazması hazırlanması için katkıda bulunmuştur.
OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |