الكشف والتحديد الكمي المنجلية في "مائي خلايا الدم الحمراء" بتخفيف مجموع انعكاس الأشعة تحت الحمراء الطيفي وتحليل البيانات متغير
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول للكشف والتحديد الكمي المنجلية في المصابين خلايا الدم الحمراء مائي استخدام الانعكاس الكلي الموهنة مطياف الأشعة تحت الحمراء وتحليل بيانات متعددة المتغيرات.
Abstract
نظهر أسلوب القياس الكمي والكشف عن الطفيليات في مائي خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) باستخدام benchtop بسيطة مطياف “يخفف مجموع انعكاس فورييه تحويل الأشعة تحت الحمراء” (أية تي آر-فتير) بالاشتراك مع (تحليل البيانات متعددة مفدا). 7 3 المنجلية مثقف للطفيليات مرحلة خاتم تطفلن 10% ويستخدم لارتفاع كرات الدم الحمراء المانحة جديدة معزولة لإنشاء إضعاف سلسلة بين 0 – 1%. ووضعت 10 ميليلتر لكل عينة في وسط النافذة الماس ATR للحصول على الطيف. وعولج نموذج البيانات لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء وإزالة مساهمة المياه، وثم طبق المشتقة الثانية لحل الخصائص الطيفية. ثم حللت البيانات باستخدام نوعين من مفدا: الأولى الرئيسية مكون تحليل (PCA) لتحديد أي القيم المتطرفة ومن ثم “انحدار المربعات الجزئية” (الثابتة والمتنقلة-R) بناء نموذج القياس الكمي.
Introduction
الملاريا من بين الأمراض الأكثر تدميرا في عصرنا؛ ويعيش أكثر من نصف السكان المعرضين للخطر في المناطق الموبوءة، وأنها تشكل عبئا غير متناسب الفقراء1،2،،من34. جزء كبير من هذه المسألة هو أعراض الناقلين وأوائل المرحلة المرضى التي تعمل كخزانات للبعوضة الناقلة5، تسبب طفرات عدوى خلال مواسم الرطب ويسمح لها بالاستمرار في المجتمعات المحلية. بسبب الملاريا خمسة المتصورة الطفيليات، وهي الأكثر دموية التي المنجلية التي تسبب أشد أشكال المرض2.
تقنيات لتشخيص الملاريا حاليا أقل من الكمال. يمكن كشف بصرية مجهرية، معيار الذهب الحالي، فقط 62-88/ميليلتر الطفيليات اعتماداً على الطريقة المستخدمة6. وعلاوة على ذلك، نظراً لكثافة والمهارة العالية المطلوبة، في العديد من مناطق الفحص المجهري ميسدياجنوسيس > 50% حالات، لا سيما المصابين بالطفيليات تدني المستويات2، التي يمكن أن تعزى مباشرة إلى الافتقار إلى الموارد في المنطقة والنتائج في إساءة استخدام العقاقير المضادة للملاريا. 2 الرئيسية التشخيص أساليب أخرى هي “الاختبارات التشخيصية السريعة” (اختبارات)، التي تستخدم الأجسام المضادة للكشف، وفحوصات Polymerase سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد)، التي تنطوي على تمييز وتحديد كمية الطفيليات من الحمض النووي. اختبارات حاليا فقط قادراً على الكشف عن المنجلية و النشيطة P. للطفيليات على الأقل 100/ميليلتر من الدم أدى إلى أشكال أكثر ندرة هذا المرض دون علاج. 7 , 8 وفي المقابل، تميز فحوصات بكر والتحديد الكمي للأنواع المختلفة من المتصورة في حساسية 0.0004-5 الطفيليات/ميليلتر دم. ومع ذلك، يتطلب الكواشف باهظة الثمن، والمعدات والمهارات التقنية، وهكذا ليست مناسبة للتطبيق الميداني.
تقنية بالغة الحساسية، ويمكن الاعتماد عليها ومعقولة أمر أساسي لتحسين تشخيص مرات، وبالتالي تحسين نتائج المرضى ومما يجعل من الممكن القضاء على المرض. مجموع انعكاس فورييه الموهنة التحويل (أية تي آر-فتير) التحليل الطيفي يقدم حل محتملة لهذه المشكلة. العمل السابقة قد أظهرت أنه من الممكن لكشف وتحديد المنجلية في الميثانول الثابتة الأفلام الدم تحقيق حدود الكشف < 1 الطفيلي/ميليلتر من الدم (< تطفلن 0.0002 ٪)9، وشبيهة بطرق PCR. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن من الممكن للكشف والتحديد الكمي للطفيليات في عينات مائي وبالتالي القضاء على خطوة التثبيت. ومع ذلك، عوامل مثل بخار الماء والضوضاء الطيفية ومعالجة البيانات بحاجة إلى أن تؤخذ في الاعتبار لتحقيق أفضل النتائج10.
هذا البروتوكول يهدف إلى إظهار المستخدمين الجدد كيفية اكتساب الأطياف ATR-فتير وإعداد نموذج انحدار للكشف عن المنجلية من العينات المائية في “خلايا الدم الحمراء” (RBC)10.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج الثابتة والمتنقلة-R هو أسلوب متعدد المتغيرات تحت إشراف يرى وجود علاقة خطية، Y = bX + ه، بين المتغيرات التنبؤية X (هنا، امتصاص في كل وافينومبير) ومستمر متغير Y (هنا، ومستوى تطفلن). وباختصار، النموذج يجمع بين المتغيرات في العاشر لإنشاء مجموعة جديدة من المتغيرات الكامنة (LVs) أن القبض على الفر?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل للمؤلفين من قبل “مجلس البحوث الأسترالية” (مستقبل الزمالة FT120100926 إلى برو)، الوطنية الصحية والطبية البحوث مجلس أستراليا (برنامج المنح و “زمالة للبحث أقدم” للبنوك؛ أوائل الوظيفي زمالات جسر؛ البنية التحتية للبحوث معاهد دعم نظام المنح للمعهد برنيت)، ودعم البنية التحتية التشغيلية حكومة الدولة الفيكتوري منحة لمعهد برنيت. ونسلم السيد فينلي شانكس لدعم دور فعال.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
- World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
