À l’aide de hybridation In Situ par Fluorescence (FISH) pour surveiller l’état des bras cohésion en prométaphase et métaphase j’ai Drosophila ovocytes

Adrienne T. Perkins; Sharon E. Bickel

doi:10.3791/56802

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Article de méthode

À l’aide de hybridation In Situ par Fluorescence (FISH) pour surveiller l’état des bras cohésion en prométaphase et métaphase j’ai Drosophila ovocytes

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DOI :

10.3791/56802

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6 décembre 2017

Adrienne T. Perkins¹ , Sharon E. Bickel¹

¹Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit présente une méthode détaillée pour la génération X-sondes de bras de chromosome et performants fluorescence in situ hybridation (poisson) pour examiner l’état de sœur cohésion des chromatides sœurs en prométaphase et métaphase que j’ai arrêté Drosophile ovocytes. Ce protocole est convenable pour déterminer si la cohésion bras méiotique est intacte ou perturbé dans différents génotypes.

Résumé

Chez l’homme, erreurs de ségrégation chromosomique dans les ovocytes sont responsables de la majorité des avortements et des malformations congénitales. En outre, comme l’âge des femmes, leur risque de concevoir qu'un fœtus aneuploïde augmente considérablement et ce phénomène est connu comme l’effet de l’âge de la mère. Une condition requise pour la ségrégation des chromosomes précis pendant les divisions méiotiques est entretien de sœur cohésion des chromatides sœurs pendant la période prolongée de la prophase que rencontrer des ovocytes. Cytologiques chez les humains et les organismes modèles suggèrent que la cohésion méiotique se détériore au cours du processus de vieillissement. En outre, des erreurs de ségrégation dans des ovocytes humains sont les plus répandus au cours de la méiose I, compatibles avec une perte prématurée de la cohésion des bras. L’utilisation d’organismes modèles est critique pour démêler les mécanismes qui sous-tendent la perte de fonction de l’âge de la cohésion. Drosophila melanogaster offre plusieurs avantages pour l’étude de la régulation de la méiose cohésion dans les ovocytes. Toutefois, jusqu'à tout récemment, seuls les tests génétiques étaient disponibles pour dosage pour la perte de cohésion du bras dans les ovocytes de génotypes différents ou dans des conditions expérimentales différentes. Ici, un protocole détaillé est fourni fluorescence in situ de l’hybridation (poisson) pour visualiser directement les défauts cohésion bras en prométaphase I et métaphase que j’ai arrêté les ovocytes de drosophile . En générant une sonde de poissons qui s’hybride au bras distal du chromosome X et la collecte des piles de Z confocale, un chercheur peut visualiser le nombre de signaux individuels de poissons en trois dimensions et déterminer si sœur chromatid bras sont séparés. La procédure décrite permet de quantifier les défauts cohésion bras dans des centaines d’ovocytes de drosophile . Par conséquent, cette méthode fournit un outil important pour étudier les mécanismes qui contribuent au maintien de la cohésion ainsi que les facteurs qui conduisent à sa disparition pendant le processus de vieillissement.

Introduction

La séparation des chromosomes pendant la mitose et la méiose exige que sœur cohésion des chromatides sœurs être créée, maintenue et publiée dans une manière coordonnée¹^,². Cohésion est établie au cours de la phase S et est véhiculée par la cohesin complexe, qui forme des liens physiques qui maintiennent la sœur chromatides ensemble. Lors de la méiose, distal par rapport à un crossover de cohésion peut également sert à tenir ensemble les homologues de recombinaison et cette association physique contribue à l’orientation correcte du bivalent sur la métaphase I de broche (Figure 1)