Evaluatie van stamcellen therapieën in een bilaterale Patellaire pees letsel Model bij ratten

Summary

Deze paper beschrijft de voorbereiding en de evaluatie van de navelstreng mesenchymale stamcellen matrix afkomstige spheroïden met een bilaterale Patellaire pees defect model in een rat. Dit model werd werd geassocieerd met een aanvaardbaar morbiditeit en gevonden voor het detecteren van de verschillen tussen onbehandelde en behandelde pezen, en tussen de twee behandelingen getest.

Abstract

Regeneratieve geneeskunde biedt nieuwe alternatieven voor voorwaarden die uitdaging van traditionele behandelingen. De prevalentie en de morbiditeit van tendinopathie over soorten, hebben gecombineerd met de beperkte helende eigenschappen van dit weefsel, gevraagd het zoeken naar cellulaire therapieën en aangedreven de ontwikkeling van experimentele modellen om te studeren van hun doeltreffendheid. Mesenchymale stamcellen, navelstreng dik, (UCM-MSC) matrix afkomstige zijn aantrekkelijke kandidaten omdat ze overvloedig, gemakkelijk te verzamelen, omzeilen de ethische bezwaren en het risico van Teratoom formatie, maar lijken op primitieve embryonale stamcellen nauwer dan volwassen weefsel afkomstige MSCs. significante belang heeft zich gericht op chitosan als een strategie ter verbetering van de eigenschappen van MSCs door sferoïde vorming. Dit papier details technieken te isoleren van de UCM-MSCs, spheroïden op chitosan film voor te bereiden en analyseren het effect van sferoïde vorming op oppervlakte marker expressie. Bijgevolg, oprichting van een bilaterale Patellaire pees letsel model bij ratten wordt beschreven voor in vivo implantatie van UCM-MSC spheroïden gevormd op chitosan film. Geen complicatie werd waargenomen in de studie met betrekking tot de morbiditeit, benadrukken stijgende effecten, of weefsel infectie. De totale functionele score van de bediende ratten op 7 dagen was lager dan dat van normale ratten, maar keerde terug naar normale binnen 28 dagen na de operatie. Histologische scores van weefsel-genezende bevestigde de aanwezigheid van een klonter in behandelde gebreken geëvalueerd op 7 dagen, afwezigheid van vreemd lichaam reactie en genezing vordert na 28 dagen. Deze bilaterale patella pees defect model was besturingselementen Inter-individuele variatie via de oprichting van een interne controle in elke rat, aanvaardbaar morbiditeit is gekoppeld en detectie van verschillen tussen onbehandelde pezen en behandelingen toegestaan.

Introduction

Pees letsel is een van de meest voorkomende oorzaken van aanzienlijke pijn en spier atrofie over soorten¹. In de diergeneeskunde zijn pees en een ligament letsel speciale belangstelling voor paarden, en 82% van alle blessures bij RAS paarden impliceren het houdings-en bewegingsapparaat, 46% van die van invloed zijn op pezen en ligamenten^2,3. Littekenvorming is van invloed op de biomechanische eigenschappen van genezen pezen en verklaart de bewaakte prognose voor terugkeer naar atletische gebruik na flexor pees verwondingen; Re-blessure treedt op binnen 2 jaar in maximaal 67% van de paarden behandeld conservatief⁴. Regeneratieve geneeskunde biedt nieuwe alternatieven voor een aandoening die traditionele behandelingen daagt. Autologe stamcel therapie heeft enkele bemoedigende resultaten^5,6 , maar wordt beperkt door de morbiditeit geassocieerd met weefsel collectie, vertraagde administratie als gevolg van verwerking/herprogrammering van de cellen en de invloed van de gezondheidstoestand van de patiënt (zoals leeftijd) op de eigenschappen van de stam cellen^7,8. Deze beperkingen geven een reden voor het onderzoeken van allogene cellen van de stam als alternatief off-the-shelf. Foetale adnexen-afgeleide cellen zijn aantrekkelijke kandidaten omdat ze omzeilen de ethische bezwaren en de kans op vorming van Teratoom embryonale stamcellen is gekoppeld. Onder foetale adnexen is navelstreng matrix (UCM), gelei van Wharton, ook wel genoemd overvloedig en gemakkelijk te verzamelen.

Ongeacht de bron van de cel is versterking van de stemness essentieel voor het opzetten van een cel bank voor allogene regeneratieve geneeskunde. Vanuit een functioneel oogpunt, kan stemness worden gedefinieerd als de mogelijkheden voor zelf-vernieuwing en multi lineage differentiatie⁹. Bewijs van stemness is afhankelijk van de proliferatie en differentiatie testen, samen met expressie van gene markeringen Nanog, Oct4en Sox2, ⁹. Een strategie ter verbetering van de stemness is afhankelijk van het gebruik van biomaterialen om te dienen als ongeldig vulstoffen en verbetering van de proliferatie en differentiatie van de UCM-MSCs vervoerders. Deze benadering elimineert bezorgdheid over manipulatie van transcriptionele factoren om te herprogrammeren van volwassen cellen in geïnduceerde pluripotente cellen. Onder biomaterialen beschouwd als potentiële dragers voor stamcellen, is chitosan aantrekkelijk voor de biocompatibiliteit en afbreekbaarheid¹⁰. Deze natuurlijke aminopolysaccharide wordt gevormd door de alkalische deacetylation van chitine, de tweede meest voorkomende natuurlijke polysacharide, hoofdzakelijk verkregen als een subproduct van schelpdieren¹⁰. We hebben eerder onderzocht van interacties tussen MSCs en chitosan steigers en waargenomen de vorming van spheroïden^{11,12,13,14,15, 16}. we ook gemeld op de superioriteit van chondrogenesis op chitosan matrices^{12,13,14,15,16,17, 18}. Meer recentelijk, twee onafhankelijke studies beschreven spheroïden formatie door vetweefsel en weefsel van de placenta afgeleid MSCs gekweekt op een chitosan film^19,20. Deze formatie van spheroïden niet alleen verbeterd stemness, maar ook het behoud van stamcellen na in vivo implantatie²⁰verbeterd.

De prevalentie en de morbiditeit van tendinopathie over soorten hebben gevraagd de ontwikkeling van experimentele modellen bestuderen de pathofysiologie van Tendinopathieën en testen van nieuwe therapieën zoals stamcel injecties. Bij paarden is collagenase-geïnduceerde tendinitis een gemeenschappelijk model aan doelmatigheid met behulp van MSCs in pees reparatie²¹aan te tonen. De relevantie van deze aanpak is beperkt, zoals injecties veroorzaken acute ontstekingsreactie, overwegende dat klinische Tendinopathieën meestal het gevolg van chronische overspannenheid^22,23. Bovendien, chemische inductie van pees ziekte induceert een genezende reactie en het verminderde genezingsproces aanwezig in klinische gevallen^22,23niet gerepliceerd. Excisie van een segment van de oppervlakkige digitale flexor pees is bestempeld als een chirurgische model van tendinitis in paarden²⁴. Meer recentelijk, een minimaal invasieve benadering werd gebruikt om de traumatische schade beperken tot de centrale kern van de oppervlakkige digitale flexor pees²⁵. Chirurgische modellen doen niet de vermoeidheid-mechanisme dat kan leiden tot natuurlijke pees ziekte, en de neiging om het gebrek aan reproduceerbaarheid in de omvang van schade gemaakt²⁵simuleren. Ongeacht het model, de morbiditeit en de kosten in verband met paarden modellen van pees zijn ziekten extra beperkingen, die een belang in knaagdier modellen te als een eerste stap voor in vivo evaluatie van nieuwe therapieën rechtvaardigen.

Een van de belangrijkste voordelen van experimentele modellen bij knaagdieren bestaat uit de kosten en de mogelijkheid om controle van Inter individuele variabiliteit. Knaagdieren kunnen worden gestandaardiseerd ten opzichte van verschillende fysiologische factoren als gevolg van hun snelle groei en relatief korte levensduur, beperking van de bronnen van variatie en dus vermindering van het aantal dieren nodig voor de detectie van verschillen. Strategieën voor het opwekken van de pees ziekten bij knaagdieren hebben vertrouwd op chemische inductie, maar ook op chirurgische oprichting van gedeeltelijke pees gebreken²¹. Chirurgische modellen natuurlijke Tendinopathieën beter dan chemische modellen kunnen simuleren, maar kunnen leiden tot hogere morbiditeit en katastrofisch mislukking van de beschadigde pees. In dat opzicht lijken ratten betere kandidaten dan muizen voor deze modellen, aangezien hun grootte staat toe de verwezenlijking van grotere defecten, teneinde de evaluatie van de genezing van weefsel te vergemakkelijken. Sprague-Dawley ratten zijn gebruikt in experimentele studies van Tendinopathieën in vier belangrijke pees groepen: rotator cuff, musculus flexor, Achilles en patellacomponenten pezen²⁶. Daaronder zijn de modellen waarbij de Patellaire pees vooral aantrekkelijk vanwege de grotere omvang van deze pees en het gemak van toegang tot het²⁷. De Patellaire pees hecht de spier van de quadriceps aan de tibiale radii. Binnen dit mechanisme extensor is de knieschijf een sesambeen die regisseert de actie van de quadriceps en bakent de proximale omvang van de Patellaire pees. De aanwezigheid van bony ankers op de proximale en distale afmetingen van de Patellaire pees vergemakkelijkt biomechanische proeven. Modellen waarbij de Patellaire pees meestal rekenen op eenzijdige chirurgische gebreken, met een contralaterale intact pees een besturingselement^28,29bijeenkomen. De meest voorkomende Patellaire pees defect model omvat middendoor van het centrale deel (1 mm in de breedte) van de Patellaire pees van de distale apex van de knieschijf naar het inbrengen van de tibiale radii, terwijl de contralaterale Patellaire pees intact is gelaten. Maatregelen van uitkomsten hebben opgenomen histologie, niet-destructieve biomechanische proefneming of biomechanische testen tot mislukking, echografie imaging ex vivo fluorescentie imaging, bruto observatie en functionele tests^{28,30 ,31}. Unilaterale modellen staan geen vergelijking van een voorgestelde behandeling met conservatieve beheer van een soortgelijke schade binnen hetzelfde dier. Vergelijking tussen verschillende behandelingen vereist ook afzonderlijke dieren. Een bilaterale model zou elimineren tussen afzonderlijke varianten en verminderen van het aantal dieren dat nodig is voor een studie³². Echter bilaterale verwondingen kunnen verhogen morbiditeit en evaluatie van de behandeling kan worden belemmerd door bilaterale kreupelheid. Het gebruik van bilaterale Patellaire pees defecten in ratten maar focus verslag een paar studies kort over de effecten van behandelingen in plaats van peri-operatieve beheer en morbiditeit van de model³³,^,34.

Doel van deze studie op lange termijn is het ontwikkelen van een strategie ter verbetering van de stemness en in vivo overleving van de UCM-MSCs bestemd voor allogene transplantatie. Om dit te bereiken, hebben we onlangs verbeterde stemness voor UCM-MSCs door vorming van spheroïden gemeld op chitosan film en incubatie onder hypoxische milieu³⁵. Deze eigenschappen in vitro werden geassocieerd met verbeterde biomechanische eigenschappen van Patellaire pees gebreken behandeld met geconditioneerde UCM-MSCs. op basis van deze resultaten, de rat bilaterale Patellaire pees defect model lijkt geschikt voor het testen van de kandidaat-lidstaten behandelingen voor pees verwondingen³⁶. Het doel van de studie gemeld hier is het verschaffen van gedetailleerde protocollen voor isolatie en karakterisatie van UCM-MSCs, voorbereiding van een biologische expresbezorgingssysteem voor stamcellen, creatie en behandeling van bilaterale patella pees gebreken en postoperatieve herstel en evaluatie van weefsel genezing binnen de gebreken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Western University of Health Sciences. 1. isolatie en uitbreiding van MSCs uit paarden navelstreng Matrix De placenta verkrijgen door een volwassen merrie (zwanger) na waargenomen veulenen en aseptisch isoleren de navelstreng van de moederkoek. Houd de navelstreng in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% penicilline-streptomycine (P/S) bij 4 ° C tijdens …

Representative Results

In de huidige studie, zijn de resultaten gepresenteerd zoals bedoel ± SD (standaarddeviatie). Cellen werden geïsoleerd uit de navelstreng koorden van 6 merries en percentage van geïsoleerde cellijnen uiting van iedere markeerdraad cel oppervlakte onder standaard of chitosan conditionering werden vergeleken met een test van Friedman, als een niet-parametrische variantie-analyse met herhaling maatregelen. Voor de pees defect model creatie, 8 ratten werden gebruikt voor 7 dagen na chirurg…

Discussion

Paarden cellen werden geselecteerd voor dit project, omdat we uiteindelijk willen beproeven van kandidaat-benaderingen in het beheer van de natuurlijke Tendinopathieën in paarden. Inderdaad, pees blessures bij paarden zijn aantrekkelijk als natuurlijke modellen van tendinopathie in de mens vanwege de biologische gelijkenis tussen de paarden oppervlakkige digitale flexor en achillespees in mens⁴¹. De cel oppervlakte markers CD44, CD90, CD105, CD34 en MHC II werden geselecteerd voor immunophenotypi…

Materials

PBS 10X	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100X	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5ml	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable