Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

Summary

Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung und Auswertung der Nabelschnur Matrix-mesenchymale Stammzellen Sphäroide mit einem bilateralen Patellasehne defekt-Modell in eine Ratte. Dieses Modell wurde wurde mit einer akzeptablen Morbidität verbunden festgestellt, dass die Unterschiede zwischen unbehandelten und behandelten sehnen erkennen und zwischen den beiden Behandlungen getestet.

Abstract

Regenerativer Medizin bietet neuartige Alternativen zu Bedingungen, die traditionelle Behandlungen herausfordern. Die Prävalenz und die Morbidität der Sehnenerkrankung Arten, kombiniert mit den begrenzten heilenden Eigenschaften dieses Gewebes, aufgefordert, die Suche nach Zelltherapien und trieb die Entwicklung der experimentellen Modellen, deren Wirksamkeit zu studieren. Nabelschnur Matrix mesenchymaler Stammzellen (UCM-MSC) sind ansprechende Kandidaten, weil sie sind reichlich vorhanden, leicht zu sammeln, zu umgehen, die ethische Bedenken und das Risiko von Teratom Bildung noch primitiven embryonalen Stammzellen mehr ähneln als Erwachsenen Gewebe abgeleitet MSCs. signifikante Interesse konzentriert sich auf Chitosan als Strategie, um die Eigenschaften des MSCs durch Sphäroid Bildung zu verbessern. Dieses Papier Details Techniken UCM-MSCs isolieren Sphäroide auf Chitosan Film vorzubereiten und analysieren die Wirkung der Sphäroid Bildung auf Surface Marker Ausdruck. Erstellung eines bilateralen Patellasehne Verletzungen Modells bei Ratten wird folglich für in Vivo Implantation der UCM-MSC Sphäroide auf Chitosan Film gebildet beschrieben. Ohne Komplikationen beobachtet wurde in der Studie in Bezug auf Morbidität, steigenden Effekte oder Gewebe Infektion zu betonen. Funktionale Gesamtpunktzahl der betriebenen Ratten nach 7 Tagen war niedriger als die von normalen Ratten, aber innerhalb von 28 Tagen nach der Operation zur Normalität zurückgekehrt. Histologischen Resultate von Heilung des Gewebes bestätigte das Vorhandensein eines Gerinnsels in behandelten Mängel 7 Tage ausgewertet aufgrund fehlender Fremdkörperreaktion und mit 28 Tagen Heilung voran. Dieses bilaterale Patella Sehne defekt Modell war steuert interindividuelle Variation durch Erstellung einer internen Kontrolle in jede Ratte mit akzeptablen Morbidität verbunden und erlaubt die Erkennung von Unterschieden zwischen unbehandelten Sehnen und Behandlungen.

Introduction

Sehnenverletzung ist eines der häufigsten Ursachen für erhebliche Schmerzen und Muskel-Atrophie Arten¹. In der Veterinärmedizin sind Sehnen und Bänder Verletzungen von besonderem Interesse bei Pferden, wie 82 % aller Verletzungen im Rennpferde des Muskel-Skelett-Systems einbeziehen, und 46 % der Befragten Einfluss auf Sehnen und Bänder^2,3. Bildung von Narbengewebe beeinflusst die biomechanischen Eigenschaften des geheilten Sehnen und erklärt die bewachte Prognose für Rückkehr zur sportlichen Nutzung nach Flexor Sehnenverletzungen; Re-Verletzung tritt innerhalb von 2 Jahren in bis zu 67 % der Pferde⁴konservativ behandelt. Regenerativer Medizin bietet neuartige Alternativen zu eine Bedingung, die traditionelle Behandlungen herausfordert. Autologe Stammzell-Therapie hat einige ermutigende Ergebnisse^5,6 aber ist begrenzt durch die Morbidität verbunden mit Gewebe Sammlung, verzögerte Verwaltung aufgrund der Verarbeitung/Neuprogrammierung der Zellen und der Einfluss von der Gesundheitszustand des Patienten (z.B. Alter) auf die Eigenschaften der Stammzellen Zellen^7,8. Diese Einschränkungen bieten eine Begründung für die Untersuchung von allogenen Stammzellen als handelsübliche Alternative. Fetale Adnexe-abgeleitete Zellen sind ansprechende Kandidaten, weil sie die ethische Bedenken und das Risiko von Teratom Bildung verbunden mit embryonalen Stammzellen umgehen. Gehört der fetalen Adnexe Nabelschnur Matrix (UCM), auch benannt Wharton Gelee, reichlich vorhanden und leicht zu sammeln.

Unabhängig von der Zelle Quelle unbedingt verbessern Stemness eine Zellbank für allogene regenerative Medizin zu etablieren. In funktioneller Hinsicht kann Stemness definiert werden als das Potenzial für die Differenzierung der Selbsterneuerung und Multi-Linie⁹. Nachweis der Stemness stützt sich auf die Proliferation und Differenzierung Assays, zusammen mit Ausdruck des Gens Marker Oct4, Sox2, und Nanog⁹. Eine Strategie zur Verbesserung der Stemness beruht auf der Verwendung von Biomaterialien als nichtig Füllstoffe und Verbesserung der Proliferation und Differenzierung der UCM-MSCs Träger dienen. Dieser Ansatz verhindert Bedenken in Bezug auf Manipulation der transcriptional Faktoren Reife Zellen in induzierte pluripotente Zellen umzuprogrammieren. Unter Biomaterialien als mögliche Träger Stammzellen zu gewinnen ist Chitosan attraktiv für seine Biokompatibilität und Abbaubarkeit¹⁰. Diese natürlichen Aminopolysaccharide bildet alkalischen Deacetylation von Chitin, das zweithäufigste natürliches Polysaccharid in erster Linie als eine Subproduct der Schalentiere¹⁰erhalten. Wir haben zuvor untersucht Wechselwirkungen zwischen MSCs und Chitosan Gerüste und beobachtet die Bildung von Sphäroide^{11,12,13,14,15, 16}. berichteten wir auch über die Überlegenheit des werden auf Chitosan Matrizen^{12,13,14,15,16,17, 18}. In jüngerer Zeit, zwei unabhängige Studien beschrieben Sphäroide Bildung von Fettgewebe und Plazenta-Gewebe abgeleitet MSCs auf einem Chitosan Film^19,20kultiviert. Diese Formation der Sphäroide nicht nur verbesserte Stemness, sondern verbessert auch die Aufbewahrung von Stammzellen nach in-Vivo Implantation²⁰.

Die Prävalenz und die Morbidität der Sehnenerkrankung Arten haben die Entwicklung der experimentellen Modellen zu studieren die Pathophysiologie der Sehnenpathologien und testen neue Therapien wie Stammzellinjektionen aufgefordert. Bei Pferden ist Kollagenase-induzierten Sehnenentzündungen ein gemeinsames Modell mit MSCs in Sehne Reparatur²¹Wirksamkeit zu demonstrieren. Die Relevanz dieses Ansatzes ist begrenzt, da Injektionen akute entzündliche Veränderungen verursachen, während klinischen Sehnenpathologien führen in der Regel aus chronische Überforderung^22,23. Darüber hinaus chemische Induktion der Sehne Krankheit induziert eine heilende Reaktion und repliziert nicht beeinträchtigten Heilungsprozess im klinischen Fällen^22,23. Exzision eines Segments der oberflächlichen Beugesehne Sehne wurde als chirurgische Modell von Tendinitis bei Pferden²⁴beschrieben. In jüngerer Zeit, war ein minimal-invasive Ansatz verwendet, um die traumatischen Schäden an den zentralen Kern der oberflächlichen Beugesehne Sehne²⁵einzuschränken. Chirurgische Modelle simuliert nicht die Müdigkeit-Mechanismus, der zu natürlichen Sehne Krankheit führen, und neigen dazu, Reproduzierbarkeit in das Ausmaß des Schadens²⁵erstellt. Unabhängig von dem Modell, die Morbidität und Kosten im Zusammenhang mit equine Modelle der Sehne sind Krankheiten zusätzliche Einschränkungen, die ein Interesse an Nager-Modelle als ein erster Schritt für in Vivo Evaluation neuartiger Therapien zu rechtfertigen.

Einer der Hauptvorteile der experimentellen Modellen bei Nagetieren besteht aus die Kosten und die Fähigkeit, interindividuelle Variabilität zu kontrollieren. Nagetiere können in Bezug auf verschiedene physiologische Faktoren aufgrund ihrer rasanten Wachstumsraten standardisiert werden und relativ kurzen Lebensspanne und Abweichungen zu begrenzen und somit Verringerung der Zahl der Tiere erforderlich, Unterschiede zu erkennen. Strategien zur Sehne Krankheiten bei Nagetieren induzieren haben chemische Induktion, sondern auch über chirurgische Einrichtung teilweise Sehne Defekte²¹verlassen. Chirurgische Modelle können natürliche Sehnenpathologien besser als chemische Modelle simulieren, sondern zu höheren Morbidität und Totalausfall der beschädigten Sehne führen können. In dieser Hinsicht scheinen Ratten bessere Kandidaten als Mäuse für diese Modelle, da ihre Größe größere Defekte, wodurch Bewertung der Heilung des Gewebes ermöglicht. Sprague-Dawley Ratten wurden in experimentellen Studien der Sehnenpathologien in vier großen Sehne Gruppen verwendet: Rotatorenmanschette, Flexor, Achilles und Patella sehnen²⁶. Unter diesen sind die Modelle mit der Patellasehne aufgrund der Größe dieser Sehne und die Leichtigkeit des Zugriffs auf es²⁷besonders reizvoll. Die Patellasehne misst die Quadrizeps tibiale Tuber. Innerhalb dieser Beinstrecker-Mechanismus ist die Patella eine sesamoid Knochen, der leitet der Aktion des Quadrizeps und umreißt das proximale Ausmaß der Patellasehne. Das Vorhandensein von knöchernen Ankern an den proximalen und distalen Ausdehnungen der der Patellasehne erleichtert biomechanische Tests. Modelle mit der Patellasehne in der Regel verlassen sich auf einseitige operative Mängel mit einer kontralateralen intakte Sehne dient als ein Steuerelement^28,29. Die häufigsten Patellasehne defekt-Modell umfasst den zentralen Teil der Patellasehne von der distalen Spitze der Patella, die Einfügung der tibiale Tuber (1 mm in der Breite) besteuert, während der kontralateralen Patellasehne intakt bleibt. Maßnahmen der Ergebnisse enthalten Histologie, zerstörungsfreie biomechanische Tests oder biomechanische Tests zu scheitern, Ultraschall-Bildgebung, ex Vivo Fluoreszenz-Bildgebung, grobe Beobachtung und Funktionstests^{28,30 ,31}. Einseitige Modelle erlauben keine Vergleich einer vorgeschlagenen Behandlung mit konservativen Management einer ähnlichen Verletzung innerhalb der selben Tier. Vergleich zwischen mehreren Behandlungen erfordert ebenso eigene Tiere. Eine bilaterale Modell würde interindividuelle Unterschiede beseitigen und reduzieren Sie die Anzahl der Tiere, die für eine Studie³²erforderlich. Jedoch bilaterale Verletzungen können Morbidität erhöhen und bilaterale Lahmheit Behandlung Bewertung behindern könnte. Einige Studien berichten kurz die Verwendung von bilateralen Patellasehne Mängel in Ratten sondern konzentrieren sich auf die Auswirkungen der Behandlungen statt Peri-operativen Management und Morbidität der das Modell^33,34.

Langfristiges Ziel dieser Studie ist zur Entwicklung einer Strategie zur Verbesserung der Stemness und in Vivo Überleben der UCM-MSCs bestimmt zur allogenen Transplantation. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir vor kurzem verbesserten Stemness der UCM-MSCs durch Bildung der Sphäroide auf Chitosan Film- und Inkubation unter hypoxischen Umwelt³⁵berichtet. Diese in-vitro- Eigenschaften waren verbunden mit verbesserten biomechanischen Eigenschaften der Patellasehne Mängel behandelt mit konditionierten UCM-MSCs. basierend auf diesen Ergebnissen, die bilateralen Patellasehne defekt Rattenmodell scheint geeignet, um Kandidaten zu testen Behandlungen für Sehne Verletzungen³⁶. Der Zweck der Studie berichtet hier ist die ausführliche Protokolle für Isolierung und Charakterisierung von UCM-MSCs, Vorbereitung eines biologischen Liefersysteme für Stammzellen, Entstehung und Behandlung von bilateralen Patella Sehne Defekte und Post-operative Erholung und Bewertung der Gewebe, die Heilung innerhalb der Mängel.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Western University of Health Sciences genehmigt. 1. Isolierung und Ausbau der MSCs von Equine Nabelschnur Matrix Erhalten Sie die Plazenta von einem Erwachsenen Mare (schwanger), nach dem Abfohlen beobachtet und aseptisch isolieren Sie die Nabelschnur aus der Plazenta. Halten Sie die Nabelschnur in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S…

Representative Results

In der aktuellen Studie werden Ergebnisse präsentiert, da ± SD (Standardabweichung) bedeuten. Zellen wurden isoliert von der Nabelschnur 6 Stuten und Prozentsatz der isolierten Zelllinien mit dem Ausdruck jeder Zelle Oberfläche Marker unter Standard- oder Chitosan Klimaanlage verglichen mit Friedman-Test als eine nicht-parametrische Varianzanalyse mit wiederholt Maßnahmen. Für die Sehne defekt Modellerstellung 8 Ratten dienten für 7 Tage nach der Operation Bewertung und 12 Ratten wu…

Discussion

Equine Zellen wurden für dieses Projekt ausgewählt, weil wir wollen schließlich Kandidat Ansätze bei der Verwaltung der natürlichen Sehnenpathologien bei Pferden zu testen. In der Tat sind Sehnenverletzungen bei Pferden wegen der biologischen Ähnlichkeit zwischen dem equine oberflächlichen Beugesehne und Achillessehne Menschen⁴¹ansprechend als natürlichen Vorbildern der Sehnenerkrankung im Menschen. Die Zelle Oberflächenmarker CD44, CD90, CD105, CD34 und MHC-II wurden für die Immunphäno…

Materials

PBS 10X	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100X	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5ml	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable