Évaluation des thérapies de cellules souches dans un modèle de blessure Tendon patellaire bilatérale chez le rat

Summary

Cet article décrit la préparation et l’évaluation des sphéroïdes matrice dérivées de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical avec un modèle de défaut du tendon patellaire bilatérale chez un rat. Ce modèle a été associé à une morbidité acceptable et a été trouvé pour détecter les différences entre les tendons non traités et traités et entre les deux traitements testé.

Abstract

Médecine régénérative fournit des solutions de rechange aux conditions qui remettent en question les traitements traditionnels. La prévalence et la morbidité de tendinopathie diverses espèces, combinées avec les propriétés curatives limitées de ce tissu, ont incité la recherche de thérapies cellulaires et propulse le développement de modèles expérimentaux d’étudier leur efficacité. Cordon ombilical matrice mésenchymateuses cellules souches dérivées (Université Complutense de Madrid-SMC) sont candidats attrayants parce qu’ils sont abondants, facile à recueillir, contourner les préoccupations éthiques et le risque de formation de tératome, pourtant plus ressemblent beaucoup à des cellules souches embryonnaires primitives que adultes dérivés de tissus significatifs MSCs. intérêt vise le chitosan comme une stratégie pour améliorer les propriétés de MSCs, par le biais de la formation sphéroïde. Ce papier détails techniques pour isoler l’UCM-MSCs, préparer des sphéroïdes sur film de chitosan et analyser l’effet de formation sphéroïde sur l’expression du marqueur de surface. En conséquence, création d’un modèle de blessure tendon patellaire bilatérale chez le rat est décrite pour l’implantation de in vivo des sphéroïdes UCM-MSC formé sur le film de chitosan. Aucune complication n’a été observée dans l’étude en ce qui concerne la morbidité, soulignons hausse des effets, ou une infection des tissus. Le score fonctionnel des rats exploités à 7 jours est inférieur à celle des rats normaux, mais revenue à la normale dans les 28 jours après la chirurgie. Les scores histologiques des tissus de guérison ont confirmé la présence d’un caillot dans les défauts traités ont évalué à 7 jours, absence de réaction à corps étranger et progresse de guérison à 28 jours. Ce modèle de défaut du tendon patellaire bilatéral contrôle la variation inter-individuelle via la création d’un contrôle interne dans chaque rat, a été associé à une morbidité acceptable et a permis la détection des différences entre les tendons non traitées et les traitements.

Introduction

Blessure au tendon est l’une des causes plus fréquentes de l’atrophie importante douleur et muscle l’ensemble de l’espèce¹. En médecine vétérinaire, lésions de tendons et ligaments sont d’un intérêt particulier chez les chevaux, que 82 % de toutes les blessures chez les chevaux de course implique le système musculo-squelettique, et 46 % de ceux qui affectent les tendons et les ligaments^2,3. Formation de tissu cicatriciel affecte les propriétés biomécaniques des tendons cicatrisés et explique le pronostic surveillé pour retour à usage sportif après des blessures de tendon fléchisseur ; nouvelle blessure survient dans les deux ans en jusqu’à 67 % des chevaux traitées conservativement⁴. Médecine régénérative fournit des solutions de rechange à une condition qui défie les traitements traditionnels. Thérapie de cellules souches autologues a produit quelques résultats encourageants^5,6 , mais est limitée par la morbidité associée à la collection de tissus, retard dans l’administration en raison de la transformation/reprogrammation de cellules et l’influence de la État de santé du patient (tels que l’âge) sur les propriétés des souches de cellules^7,8. Ces limitations plaident en faveur d’enquêter sur les cellules souches allogéniques comme alternative standard. Cellules foetales dérivées de ses annexes sont candidats attrayants car ils contourner les préoccupations éthiques et le risque de formation de tératome associée à des cellules souches embryonnaires. Parmi les annexes fœtales, cordon ombilical de matrice (UCM), aussi nommée la gelée de Wharton, est abondante et facile à percevoir.

Quelle que soit la source des cellules, améliorer stemness est essentielle pour établir une banque de cellules pour la médecine régénérative allogénique. D’un point de vue fonctionnel, stemness peut être défini comme le potentiel de différenciation autorenouvellement et lignées multiples⁹. Preuve de stemness s’appuie sur la prolifération et la différenciation des essais, ainsi que de l’expression des gènes marqueurs Oct4, Sox2 et Nanog⁹. Une stratégie visant à améliorer la stemness repose sur l’utilisation des biomatériaux pour servir de Sub remplisseurs et transporteurs améliorant la prolifération et la différenciation de l’UCM-MSCs. Cette approche élimine les préoccupations au sujet de la manipulation des facteurs transcriptionnels de reprogrammer des cellules adultes en cellules pluripotentes induites. Parmi les biomatériaux considérés comme potentiellement porteurs de cellules souches, chitosan lance un appel pour sa biocompatibilité et dégradabilité¹⁰. Cette aminopolysaccharide naturelle est formée par désacétylation alcaline de chitine, le polysaccharide naturel deuxième plus abondant, obtenue principalement comme un sous-produit de crustacés¹⁰. Nous avons précédemment étudié les interactions entre MSCs et échafaudages de chitosan et observé la formation de sphéroïdes^{11,12,13,14,15, 16}. nous avons également rapporté sur la supériorité de chondrogenèse le chitosan matrices^{12,13,14,15,16,17, 18}. Plus récemment, deux études indépendantes décrit sphéroïdes formation par le tissu adipeux et le tissu placentaire dérivé MSCs cultivés sur un chitosan film^19,20. Cette formation des sphéroïdes a non seulement amélioré stemness, mais également amélioré le maintien des cellules souches après in vivo implantation²⁰.

La prévalence et la morbidité de tendinopathie diverses espèces ont incité le développement de modèles expérimentaux d’étudier la physiopathologie des tendinopathies et de tester de nouveaux traitements tels que des injections de cellules souches. Chez les chevaux, induite par la collagénase tendinite est un modèle commun de démontrer l’efficacité de l’utilisation de MSCs dans la réparation de tendon²¹. La pertinence de cette approche est limitée, comme les injections provoquent des changements inflammatoires aigus, alors que les tendinopathies cliniques résultent habituellement de chronique surmenage^22,23. En outre, induction chimique de maladie du tendon entraîne une réponse de guérison et ne réplique pas le processus de guérison visuels présent dans les cas cliniques^22,23. L’excision d’un segment du tendon fléchisseur digital superficiel a été décrit comme un modèle chirurgical de la tendinite en chevaux²⁴. Plus récemment, une approche mini-invasive a été utilisée pour restreindre les dommages traumatiques de la partie centrale du tendon fléchisseur digital superficiel²⁵. Les modèles chirurgicaux ne pas simuler le mécanisme de fatigue qui peut conduire à une maladie naturelle de tendon et tendent à manque de reproductibilité dans l’étendue des dommages créé²⁵. Quel que soit le modèle, la morbidité et le coût associé aux modèles équines du tendon maladies sont des limitations supplémentaires, qui justifient d’un intérêt pour les modèles de rongeurs dans un premier temps pour in vivo l’évaluation de nouveaux traitements.

L’un des principaux avantages des modèles expérimentaux chez les rongeurs consiste le coût et la capacité de contrôler la variabilité interindividuelle. Les rongeurs peuvent être normalisées en ce qui concerne les divers facteurs physiologiques en raison de leur taux de croissance rapide et relativement courtes durées de vie, limiter les sources de variation et donc réduire le nombre d’animaux requis pour détecter les différences. Stratégies d’induire des maladies tendon chez les rongeurs sont sont appuyés sur l’induction chimique, mais aussi sur la création chirurgicale du tendon partielle défauts²¹. Les modèles chirurgicaux peuvent simuler des tendinopathies naturels mieux que les modèles chimiques, mais peuvent entraîner une morbidité plus élevée et une défaillance catastrophique du tendon endommagé. À cet égard, des rats semblent meilleurs candidats que les souris pour ces modèles, car leur taille permet la création des plus grands défauts, facilitant ainsi l’évaluation de la guérison des tissus. Rats Sprague-Dawley ont été utilisés dans des études expérimentales de tendinopathies en quatre groupes principaux tendons : coiffe des rotateurs, fléchisseurs, Achille et tendons rotuliens²⁶. Parmi ceux-ci, les modèles impliquant le tendon rotulien sont particulièrement attrayants en raison de la grande taille de ce tendon et la facilité d’y accéder à²⁷. Le tendon rotulien s’attache le muscle quadriceps de la tubérosité tibiale. Au sein de cet appareil extenseur, la rotule est un OS sésamoïde qui dirige l’action du quadriceps et délimite l’étendue proximale du tendon rotulien. La présence des ancrages osseux à l’étendue proximale et distale du tendon rotulien facilite les tests biomécaniques. Modèles impliquant le tendon rotulien en général dépendent des défauts chirurgicales unilatérales, avec un tendon intact controlatéral, agissant comme un contrôle^28,29. Le modèle de défaut de tendon rotulien plus courant consiste à exciser la partie centrale (1 mm de largeur) du tendon rotulien de l’apex distale de la rotule à l’insertion de la tubérosité tibiale, tandis que le tendon rotulien controlatéral est laissé intact. Mesures des résultats ont inclus l’histologie, les essais non destructifs de biomécanique ou tests biomécaniques à l’insuffisance, échographie, imagerie de fluorescence ex vivo , observation brute et tests fonctionnels^{28,30 ,},³¹. Les modèles unilatérales ne permettent pas de comparaison entre un traitement proposé et gestion conservatrice d’une blessure similaire dans le même animal. De même, la comparaison entre plusieurs traitements nécessite animaux distincts. Un modèle bilatéral éliminerait les variations entre individus et réduire le nombre d’animaux requis pour une étude de³². Cependant, les lésions bilatérales peuvent augmenter la morbidité et boiterie bilatérale susceptibles d’entraver évaluation de traitement. Quelques études rapportent brièvement l’utilisation des défauts de tendon patellaire bilatérale chez les rats mais se concentrer sur les effets des traitements plutôt que gestion périopératoire et la morbidité de la modèle^33,,³⁴.

Objectif à long terme de cette étude est d’élaborer une stratégie pour améliorer la survie stemness et in vivo de l’UCM-MSCs destinés à une transplantation allogénique. Pour atteindre cet objectif, nous avons récemment rapporté stemness améliorée de l’UCM-MSCs par formation de sphéroïdes sur film de chitosan et d’incubation sous environnement hypoxique³⁵. Ces propriétés in vitro ont été associées à améliorée propriétés biomécaniques des défauts de tendon rotulien traités avec conditionné UCM-MSCs. se fondant sur ces résultats, le modèle de défaut du tendon patellaire bilatéral rat semble approprié pour tester les candidats traitements pour tendon blessures³⁶. Le but de l’étude a signalé ici est de fournir des protocoles détaillés pour l’isolement et la caractérisation de l’UCM-MSCs, préparation d’un système de livraison biologique des cellules souches, de création et de traitement des défauts de tendon patellaire bilatérale et post-operative récupération et évaluation des tissus de guérison dans les défauts.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de Western University of Health Sciences. 1. isolement et Expansion de MSCs de matrice équine du cordon ombilical Obtenir le placenta d’une jument adulte (enceinte) après avoir observé le poulinage et isoler aseptiquement le cordon ombilical du placenta. Gardez le cordon ombilical dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 1 % de pénicilline-s…

Representative Results

Dans la présente étude, les résultats sont présentés comme moyenne ± écart-type (écart-type). Les cellules ont été isolés dans les cordons ombilicaux de 6 juments et pourcentage des lignées de cellules isolées exprimant chaque marqueur de surface cellulaire sous conditionnement standard ou chitosan ont été comparés avec un test de Friedman, comme une analyse de variance non-paramétrique avec répété mesures. Pour la création de modèles de défaut de tendon, 8 rats ont…

Discussion

Cellules équines ont été choisis pour ce projet, parce que finalement, nous avons l’intention de tester des approches de candidat dans la gestion des tendinopathies naturel chez le cheval. En effet, les blessures de tendon chez les chevaux sont attrayants comme modèles naturels de tendinopathie chez l’homme en raison de la similitude biologique entre l’équine flexor digital superficiel et le tendon d’Achille dans les humains⁴¹. Les marqueurs de surface cellulaires CD44, CD90 CD105, CD…

Materials

PBS 10X	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100X	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5ml	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable