JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Chemistry

Phthalater syre Ester-bindende DNA Aptamer udvalg, karakterisering og ansøgning til en elektrokemisk Aptasensor

Published: March 21, 2018
doi:
10.3791/56814
, , , , ,
1Department of Chemistry,Capital Normal University, 2College of Life Sciences,Capital Normal University

Summary

En protokol til in vitro- udvælgelse og karakterisering af gruppespecifikke phthalater syre ester-bindende DNA aptamers præsenteres. Anvendelsen af den valgte aptamer i en elektrokemisk aptasensor er også inkluderet.

Abstract

Phthalater acid estere (PAEs) areone i de store grupper af persistente organiske miljøgifte. Gruppe-specifik påvisning af PAEs er meget eftertragtede på grund af den hurtige voksende kongeneres. DNA aptamers er blevet i stigende grad anvendt som anerkendelse elementer på biosensor platforme, men at vælge aptamers mod stærkt hydrofobe lille molekyle mål, såsom PAEs, er sjældent rapporteret. Dette arbejde beskriver en perle-baserede metode designet til Vælg gruppe-specifikke DNA aptamers til PAEs. Aminogruppen functionalized dibutylphthalat (DBP-NH2) som anker mål blev syntetiseret og immobiliseret på epoxy-aktiveret Agarosen perler, tillader visning af gruppen phthalic ester på overfladen af matrixen immobilisering og Derfor valget af gruppespecifikke bindemidler. Vi bestemt dissociation konstanter aptamer kandidater af kvantitative polymerisering kædereaktion kombineret med magnetisk separation. Den relative tilhørsforhold og selektivitet af aptamers til andre PAEs blev bestemt af de konkurrencedygtige assays, hvor aptamer kandidater var pre afgrænset til DBP-NH2 knyttet magnetiske perler og frigivet til supernatanten ved inkubering med de testede PAEs eller andre potentielle interfererende stoffer. Konkurrencedygtige analysen blev anvendt, fordi den gav en letkøbt affinitet sammenligning blandt PAEs, der havde ingen funktionelle grupper for overflade immobilisering. Endelig, vi viste fabrikation af en elektrokemisk aptasensor og brugte den til ultrasensitive og selektiv påvisning af bis(2-ethylhexyl) phthalat. Denne protokol giver indsigt aptamer opdagelsen af andre hydrofobe små molekyler.

Introduction

Sammen med hurtig økonomisk udvikling er acceleration af industrialisering og bybygning, miljøforurening mere alvorlige end nogensinde. Typiske miljøforurenende omfatter heavy metal ioner, toksiner, antibiotika, pesticider, endokrine disruptorer og persistente organiske miljøgifte (pop). Udover metal-ioner og toksiner, andre forurenende stoffer er små molekyler der ganske ofte består af en række forskellige kongenere. For eksempel, de mest giftige POP’er omfatter polychlorerede biphenyler (PCB), polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH), polybromerede diphenyl ethere (PBDE), polychlorerede dibenzo-p-dioxiner (PCDD), polychlorerede dibenzofuraner (PCDF), og phthalic Acid estere (PAEs)1,2, som alle består af mange kongenere. Lille molekyle opdagelse er blevet primært udført af kromatografi/masse massespektrometri-baseret teknikker på grund af deres mangfoldighed af programmer3,4,5,6. For on-site opdagelser, er antistof-baserede metoder for nylig blevet udviklet7,8,9. Men da disse metoder er meget specifikke for en bestemt kongeners, flere prøver skal udføres. Hvad er mere alvorligt er at de roman kongenere vokser så hurtigt at deres antistoffer ikke kan oprettes i tid. Derfor kan udviklingen af gruppespecifikke biosensorer til at overvåge de samlede niveauer af alle kongenere i én test udgør en uvurderlig metrikværdi for at vurdere miljøforurening status.

For nylig, nukleinsyre aptamers er blevet bredt anvendt som anerkendelse elementer i forskellige biosensing platforme på grund af deres evne til erkendelse af en bred vifte af mål, fra ioner og små molekyler til proteiner og celler10,11 ,12. Aptamers er identificeret gennem en in vitro- metode, der kaldes systematisk udvikling af ligander af eksponentielle berigelse (SELEX)13,14. SELEX begynder med tilfældige syntetiske enkelt streng oligonukleotid bibliotek, som indeholder ca 1014-1015 sekvenser. Størrelsen af den tilfældige bibliotek sikrer mangfoldighed af RNA eller DNA kandidat strukturerne. Den typiske SELEX proces består af flere runder af berigelse indtil biblioteket er beriget i sekvenser med høj affinitet og specificitet til målet. Den endelige beriget pool er derefter sekventeret, og dissociation konstanter (Kd) og selektivitet mod potentielle interfererende stoffer bestemmes ved hjælp af forskellige teknikker såsom filter bindende affinitet kromatografi, overflade Plasmon resonans (SPR), osv. 15

På grund af ekstremt fattige vandopløselighed og manglen på funktionelle grupper for overflade immobilisering er aptamer Udvalget af dukker teoretisk vanskeligt. Betydelige fremskridt for SELEX har fremskyndet opdagelsen af aptamers. Dog har udvalg af gruppe-specifikke aptamers for pop ikke endnu blevet rapporteret. Hidtil har kun PCB-bindende DNA aptamers med høj specificitet for en bestemt kongeners blevet identificeret16. PAEs anvendes hovedsageligt i polyvinylchlorid materialer, skiftende polyvinylchlorid fra en hård plast til en elastisk plast, dermed fungere som en blødgører. Nogle PAEs er blevet identificeret som hormonforstyrrende stoffer, kan forårsage alvorlige skader til lever- og nyrefunktion, reducere motilitet af mandlige sædceller, og kan resultere i abnorm sperm morfologi og testikelkræft17. Hverken stof- eller gruppe-specifikke PAE-bindende aptamers er blevet rapporteret.

Målet med dette arbejde er at give en repræsentativ protokol for at vælge gruppe-specifikke DNA aptamers til yderst hydrofobe små molekyler såsom PAEs, en repræsentativ gruppe af dukker. Vi viser også anvendelsen af de valgte aptamer til registrering af miljøforurening. Denne protokol giver vejledning og indsigt for aptamer opdagelsen af andre hydrofobe små molekyler.

Protocol

1. bibliotek og Primer Design og syntese Designe det første bibliotek og primere.Bibliotek (Pool0): 5′-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3’Videresende primer (FP): 5′-TCCCACGCATTCTCCACATC-3’Fosforyleret omvendt primer (PO4- RP): 5′-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3′ Syntetisere Pool0, FP og PO4- RP ved hjælp af standard phosphoramidite kemi18,19,<…

Representative Results

Vi designet og syntetiseret aminogruppen functionalized dibutylphthalat (DBP-NH2) som anker mål (figur 1F). Vi har derefter gennemført DNA aptamer udvalg af PAEs ved hjælp af DBP-NH2 som anker mål og efter klassisk mål immobilisering-baseret metode (figur 2). I hver runde, blev en pilot PCR udført ved hjælp af denatureret side for at optimere cyklus antallet af PCR (figur 3</stron…

Discussion

En enestående fordel ved aptamers er, at de er identificeret gennem in vitro- metoden SELEX, mens antistoffer er genereret via i vivo immunoreactions. Derfor kan aptamers vælges med ønskede mål specificitet under veldesignet forsøgsbetingelser, antistoffer er begrænset til fysiologiske tilstande.

For at lette adskillelsen af bundne sekvenser fra gratis sekvenser, flere modificerede SELEX er for nylig blevet rapporteret, i hvilke kapillær elektroforese…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er taknemmelige for finansiel støtte fra National Natural Science Foundation (21675112), Key projekt af videnskab og teknologi plan af Beijing uddannelse Kommissionen (KZ201710028027) og Yanjing Young Scholars Program af kapital Normal University.

Materials

UV-2550 Shimadzu,Japan protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 BIO-RAD section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch BIO-RAD section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat Bio-Logic Science, Claix, France section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 10220020 argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads Invitrogen, USA 420420 magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version Takara,Dalian,China R028A polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane Bemis, USA PM-996 section 3.6.5
Lambda Exonuclease Invitrogen, USA EN0561 section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		 Takara,Dalian,China 9094 section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit Sangon Biotech (Shanghai) B511135 section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen, USA 1811838 nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II Takara,Dalian,China RR820A polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) Sigma-Aldrich CAS: 1132-61-2 section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) Invitrogen, USA CAS: 25952-53-8 section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 6066-82-6 section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH) Sigma-Aldrich CAS: 1633-78-9 section 7.7
Gold electrode Shanghai Chenhua CHI101 section 7.4. – 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich CAS: 51805-45-9 section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) Sigma-Aldrich CAS: 651042-82-9 section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP) National Institute of Metrology, China CAS: 117-81-7 section 7.11
Tween 20 Sigma-Aldrich CAS: 9005-64-5 polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100 Sigma-Aldrich CAS: 9002-93-1 non-ionic surface active agent
PBS Sigma-Aldrich P5368 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
  2. Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
  3. Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
  4. Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
  5. Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
  6. Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
  7. Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
  8. Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
  9. Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
  10. Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
  11. Yin, X. -. B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
  12. Nguyen, V. -. T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
  13. Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
  14. Yang, K. -. A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
  15. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  16. Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
  17. Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
  18. Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
  19. Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
  20. Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
  21. Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
  22. Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
  23. Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
  24. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
  25. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
  26. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
  27. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
  28. Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
  29. Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
  30. Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
  31. Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
  33. Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
  34. Song, K. -. M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
  35. Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
  36. Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
  37. Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
  38. Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).

Tags

Phthalic Acid EsterDNA AptamerElectrochemical AptasensorHydrophobic MoleculesGroup-specific AptamersLambda ExonucleaseNative PAGE GelMagnetic BeadsPAE Binding Buffer
check_url/56814?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wu, X., Diao, D., Lu, Z., Han, Y., Xu, S., Lou, X. Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor. J. Vis. Exp. (133), e56814, doi:10.3791/56814 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image