Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor

Summary

Een protocol voor de in vitro selectie en karakterisering van groepsspecifieke ftaalzuur ester-binding DNA aptamers wordt gepresenteerd. De toepassing van de geselecteerde aptamer in een elektrochemische aptasensor is ook inbegrepen.

Abstract

Ftaalzuur esters (PAEs) areone van de grote groepen van persistente organische verontreinigende stoffen. De groepsspecifieke detectie van PAEs is zeer gewenst als gevolg van de snel groeiende van congeneren. DNA aptamers zijn steeds meer toegepast als erkenning elementen op biosensor platformen, maar selecteren aptamers richting zeer hydrofobe klein molecuul doelen, zoals PAEs, is zelden gerapporteerd. Dit werk beschrijft een kraal gebaseerde methode ontworpen om te selecteren groepsspecifieke DNA aptamers aan PAEs. De aminogroep matiemaatschappij dibutylftalaat (DBP-NH₂) zoals het anker doel werd gesynthetiseerd en geïmmobiliseerd op de epoxy-geactiveerde agarose parels, waardoor de weergave van de ftaal ester-groep aan het oppervlak van de immobilisatie-matrix, en Daarom is de selectie van de groepsspecifieke bindmiddelen. Wij vastbesloten de dissociatieconstanten van de aptamer kandidaten door kwantitatieve polymerisatie kettingreactie van magnetische scheiding wordt gekoppeld. De relatieve affiniteiten en de selectiviteit van de aptamers aan andere PAEs werden bepaald door de concurrerende testen, waar de aptamer kandidaten waren vooraf begrensd aan de DBP-NH₂ aangesloten magnetische kralen en vrijgegeven aan het supernatans dat na incubatie met de geteste PAEs of andere potentieel storende stoffen. De concurrerende assay werd toegepast omdat het verstrekt een vergelijking van de facile affiniteit tussen PAEs die had geen functionele groepen voor oppervlakte immobilisatie. Tot slot, wij aangetoond van de fabricage van een elektrochemische aptasensor en gebruikt voor ultrasensitive en selectieve detectie van bis(2-ethylhexyl) ftalaat. Dit protocol biedt inzichten voor de ontdekking van de aptamer van andere hydrofobe kleine moleculen.

Introduction

Samen met de snelle economische ontwikkeling is versnelling van de industrialisatie en de bouw van het stedelijk, milieuvervuiling ernstiger dan ooit. Typische milieuverontreinigende stoffen zijn zware metaal ionen, toxinen, antibiotica, bestrijdingsmiddelen, hormoonontregelaars en persistente organische verontreinigende stoffen (POP’s). Naast metaalionen en toxines, andere verontreinigende stoffen zijn kleine moleculen dat heel vaak bestaan uit een verscheidenheid van congeneren. De meest giftige POP’s bijvoorbeeld polychloorbifenylen (PCB’s), polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK’s), bifenyl polybroomdifenylethers (PBDE’s), polychloordibenzo-p-dioxines (PCDD’s), polychloorbifenylen polychloordibenzofuraancongeneren (PCDF’s), en ftaal esters van (PAEs)^1,2, die alle bestaan uit vele congeneren. Klein molecuul detectie is voornamelijk uitgevoerd door chromatografie/massa spectrometrie gebaseerde technieken als gevolg van hun verscheidenheid van toepassingen^3,,^4,,^5,6. Voor on-site detecties, hebben antilichamen gebaseerde methoden onlangs ontwikkelde^7,8,9. Echter, aangezien deze methoden zeer specifiek voor een bepaalde congeneer zijn, meerdere proeven moeten worden uitgevoerd. Wat ernstiger is, is dat de roman congeneren zo snel groeien dat hun antilichamen kunnen niet worden gegenereerd in de tijd. Dus, de ontwikkeling van groepsspecifieke biosensoren te controleren van het totale gehalte aan alle congeneren in één test kan voorzien in een onschatbare waarde metric milieuvervuiling status beoordelen.

Onlangs, nucleic zuur aptamers wijd zijn toegepast als erkenning elementen in verschillende biosensing platformen als gevolg van hun vermogen van de erkenning van een grote verscheidenheid van doelen, van ionen en kleine moleculen aan eiwitten en cellen^{10,11 ,12}. Aptamers worden geïdentificeerd door middel van een in vitro -methode aangeroepen systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX)^13,14. SELEX begint met de willekeurige synthetische enkele streng oligonucleotide bibliotheek, die ongeveer 10¹⁴-10¹⁵ fragmenten bevat. De grootte van de willekeurige bibliotheek zorgt ervoor dat de diversiteit van de RNA of DNA kandidaat-structuren. Het typische SELEX proces bestaat uit meerdere rondes van verrijking totdat de bibliotheek is verrijkt met sequenties met hoge affiniteit en specificiteit naar het doel. Het laatste verrijkt zwembad is dan sequenced en de dissociatieconstanten (K_d) en selectiviteit tegen potentieel storende stoffen worden bepaald door verschillende technieken zoals filteren bindend, chromatografie van de affiniteit, oppervlakte Plasmon resonantie (SPR), enz. ¹⁵

Vanwege de extreem slechte water oplosbaarheid en gebrek aan functionele groepen voor oppervlakte immobilisatie is de selectie van de aptamer van POP’s theoretisch moeilijk. Significante vooruitgang voor SELEX hebben versneld van de ontdekking van aptamers. Echter, de selectie van groepsspecifieke aptamers voor POP’s heeft nog niet is gerapporteerd. Tot nu toe geweest alleen PCB-bindende DNA aptamers met hoge specificiteit voor een bepaalde congeneer geïdentificeerde¹⁶. PAEs worden hoofdzakelijk gebruikt in polyvinylchloride materialen, polyvinylchloride van een hard plastic omzetten in een elastische kunststof, dus die fungeert als een weekmaker. Sommige PAEs zijn geïdentificeerd als endocriene verstoorders, kan ernstige schade veroorzaken aan de lever en nierfunctie, beperken de beweeglijkheid van de mannelijke zaadcellen, en kan resulteren in abnormale sperma morfologie en testiculaire kanker¹⁷. De compound- noch groepsspecifieke PAE-bindende aptamers zijn gemeld.

Het doel van dit werk is bedoeld als een representatieve protocol voor het selecteren van groepsspecifieke DNA aptamers met zeer hydrofobe kleine molecules zoals PAEs, een representatieve groep van POP’s. We tonen ook de toepassing van de geselecteerde aptamer voor milieuvervuiling opsporen. Dit protocol biedt begeleiding en inzichten voor de ontdekking van de aptamer van andere hydrofobe kleine moleculen.

Protocol

1. bibliotheek en Primer Design en synthese De eerste bibliotheek en inleidingen ontwerpen.Bibliotheek (groep0): 5′-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3’Toekomen primer (FP): 5′-TCCCACGCATTCTCCACATC-3’Phosphorylated omgekeerde primer (PO4- RP): 5′-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3′ Synthetiseren zwembad0, FP en PO4- RP met behulp van standaard phosphoramidite chemie18,<sup class…

Representative Results

We ontworpen en gesynthetiseerd de aminogroep matiemaatschappij dibutylftalaat (DBP-NH2) als het anker doel (figuur 1F). We uitgevoerd dan de DNA aptamer selectie van PAEs DBP-NH2 gebruikt als anker doel en na de klassieke doel immobilisatie gebaseerde methode (Figuur 2). In elke ronde, werd een pilot PCR uitgevoerd met behulp van de gedenatureerde pagina voor het optimaliseren van het nummer van de cyclus v…

Discussion

Een uitstekende voordeel van aptamers is dat ze worden geïdentificeerd door middel van de methode in vitro SELEX, hoewel antilichamen worden gegenereerd via in vivo immunoreactions. Daarom, aptamers kunnen worden geselecteerd met de gewenste doelgroep specificiteit uit hoofde van goed ontworpen proefomstandigheden, overwegende dat antilichamen beperkt tot de fysiologische omstandigheden zijn.

Ter vergemakkelijking van de scheiding van afhankelijke sequenties van gratis seque…

Materials

UV-2550	Shimadzu,Japan		protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200	BIO-RAD		section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch	BIO-RAD		section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat	Bio-Logic Science, Claix, France		section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	10220020	argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads	Invitrogen, USA	420420	magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version	Takara,Dalian,China	R028A	polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane	Bemis, USA	PM-996	section 3.6.5
Lambda Exonuclease	Invitrogen, USA	EN0561	section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE Precipitation Carrier	Takara,Dalian,China	9094	section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B511135	section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Invitrogen, USA	1811838	nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II	Takara,Dalian,China	RR820A	polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	CAS: 1132-61-2	section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Invitrogen, USA	CAS: 25952-53-8	section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	6066-82-6	section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH)	Sigma-Aldrich	CAS: 1633-78-9	section 7.7
Gold electrode	Shanghai Chenhua	CHI101	section 7.4. – 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	CAS: 51805-45-9	section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	CAS: 651042-82-9	section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP)	National Institute of Metrology, China	CAS: 117-81-7	section 7.11
Tween 20	Sigma-Aldrich	CAS: 9005-64-5	polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100	Sigma-Aldrich	CAS: 9002-93-1	non-ionic surface active agent
PBS	Sigma-Aldrich	P5368	10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4