Phthalic Acid Ester-liaison ADN aptamère sélection, caractérisation et Application d’un Aptasensor électrochimique
Summary
Un protocole de sélection de in vitro et la caractérisation de l’acide phtalique spécifique au groupe ester-liaison ADN aptamères est présenté. L’application de l’aptamère sélectionné dans un aptasensor électrochimique est également incluse.
Abstract
Phthalic acid esters (PAEs) areone des grands groupes de polluants organiques persistants. La détection de groupes spécifiques de PAEs est hautement souhaitée en raison de la croissance rapide des congénères. Aptamères ADN ont été appliquées de plus en plus en tant qu’éléments de reconnaissance sur les plates-formes de biocapteur, mais en sélectionnant aptamères pour atteindre les cibles hautement hydrophobes de petites molécules, telles que PAEs, sont rarement rapporté. Cet ouvrage décrit une méthode axée sur le talon conçue pour sélectionner les aptamères ADN spécifiques à un groupe de PAEs. Le groupement aminé fonctionnalisé phtalate de dibutyle (DBP-NH2) comme la cible de l’ancre a été synthétisée et immobilisée sur les perles de l’agarose époxy-activé, permettant d’afficher le groupe ester phtalique à la surface de la matrice de l’immobilisation, et par conséquent, le choix des liants spécifiques à un groupe. Nous avons déterminé les constantes de dissociation des candidats aptamère par réaction en chaîne de polymérisation quantitative couplée avec séparation magnétique. Les affinités relatives et la sélectivité des aptamères à autres PAEs ont été déterminées par les essais concurrentiels, où les candidats aptamère ont été préalablement délimitées à la DBP-NH2 attaché billes magnétiques et rejetés dans le surnageant après incubation avec la PAEs testée ou autres substances interférentes potentiels. L’analyse concurrentielle a été appliquée parce qu’il a fourni une comparaison facile affinité entre PAEs qui n’avait aucun groupes fonctionnels pour l’immobilisation de la surface. Enfin, nous avons démontré la fabrication d’un aptasensor électrochimique et utilisé pour détection ultrasensible et sélective de phtalate de 2-éthylhexyle. Ce protocole prévoit des idées pour la découverte d’aptamère d’autres petites molécules hydrophobes.
Introduction
Ainsi que le développement économique rapide, accélération de l’industrialisation et la construction urbaine, pollution de l’environnement est plus sévère que jamais. Les polluants environnementaux typiques comprennent les ions de métaux lourds, toxines, antibiotiques, pesticides, perturbateurs endocriniens et les polluants organiques persistants (POP). En plus des ions métalliques et des toxines, autres polluants sont de petites molécules qui sont souvent constituées d’une variété de congénères. Par exemple, la pop plus toxiques comprennent des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), les éthers biphényles polybromés (PBDE), des polychlorodibenzo-p-dioxines (PCDD), les biphényles polychlorés (BPC), dibenzofurannes polychlorés (PCDF) et phtalique esters de l’acide (PAEs)1,2, qui toutes se composent de plusieurs congénères. Détection de petites molécules a été principalement réalisée par chromatography/mass spectrometry sur des techniques en raison de la diversité des applications3,4,5,6. Pour la détection sur place, les méthodes axées sur les anticorps ont été récemment développés7,8,9. Toutefois, étant donné que ces méthodes sont hautement spécifiques pour certain un congénère, plusieurs essais sont effectués. Ce qui est plus grave, c’est que les nouveaux congénères grandissent si vite que leurs anticorps ne peuvent pas être générés dans le temps. Par conséquent, le développement de biocapteurs spécifique pour surveiller les niveaux totaux de tous les congénères lors d’un test peut fournir une métrique de précieuse pour évaluer l’état de la pollution de l’environnement.
Récemment, les aptamères nucléotidiques ont été largement appliquées comme éléments de reconnaissance dans les diverses plateformes de biodétection en raison de leur capacité à reconnaître une grande variété de cibles, d’ions et de petites molécules de protéines et cellules10,11 ,,12. Aptamères sont identifiés au moyen d’une méthode in vitro appelée évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX)13,14. SELEX commence avec la bibliothèque d’oligonucléotides monocaténaires synthétique aléatoire, qui contient environ 10 séquences de15 14-10. La taille de la bibliothèque aléatoire assure la diversité des structures candidat ARN ou ADN. Le processus typique de SELEX se compose de plusieurs tours d’enrichissement jusqu’à ce que la bibliothèque est enrichie en séquences avec grande affinité et spécificité à la cible. La poule finale enrichie est ensuite séquencée, et les constantes de dissociation (Kd) et la sélectivité contre potentiel substances interférentes sont déterminées par différentes techniques telles que filtrent binding, chromatographie d’affinité, surface résonance plasmon (SPR), etc. 15
En raison de la solubilité dans l’eau est extrêmement faible et manque de groupes fonctionnels pour l’immobilisation de la surface, l’aptamère pop est théoriquement difficile. Des avancées significatives pour SELEX ont accéléré la découverte d’aptamères. Toutefois, la sélection des aptamères spécifiques à un groupe de pop n’a pas encore été signalée. Jusqu’à présent, seulement PCB-liaison ADN aptamères avec grande spécificité pour certain un congénère ont été identifiés16. PAEs sont principalement utilisés dans les matériaux de polychlorure de vinyle, changeant de polychlorure de vinyle plastique dur à un élastique plastique, agissant ainsi comme un plastifiant. Certains PAEs ont été identifiés comme des perturbateurs endocriniens, peut causer des dommages graves au foie et de la fonction rénale, réduire la motilité des spermatozoïdes mâles et peuvent entraîner la morphologie des spermatozoïdes anormaux et cancer du testicule,17. Le composé – ni aptamères PAE-liaison spécifique à un groupe ont été signalés.
L’objectif de ce travail est de fournir un protocole représentatif de sélection spécifique au groupe ADN aptamères à fortement hydrophobes petites molécules telles que PAEs, un groupe représentatif des polluants organiques persistants. Nous démontrons également l’application de l’aptamère sélectionné pour la détection de la pollution de l’environnement. Ce protocole fournit des conseils et des idées pour la découverte d’aptamère d’autres petites molécules hydrophobes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un des avantages exceptionnels d’aptamères sont qu’ils sont identifiés par le biais de la méthode in vitro SELEX, tandis que les anticorps sont générés via in vivo immunoreactions. Par conséquent, aptamères sont sélectionnables avec spécificité de cible souhaitée dans des conditions expérimentales bien conçues, alors que les anticorps se limitent aux conditions physiologiques.
Pour faciliter la séparation des séquences liées des séquences gratuits, SELEX…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants pour le soutien financier de la Fondation nationale des sciences naturelles (21675112), projet clé du plan sciences et technologies de la Commission de l’éducation de Pékin (KZ201710028027) et Yanjing jeune savant programme de Capital Normal University.
Materials
| UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
| VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
| Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
| Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. – 7.11 |
| tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
| diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |
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