Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA-Aptamer Auswahl, Charakterisierung und Anwendung eines elektrochemischen Aptasensor
Summary
Ein Protokoll für die in-vitro- Selektion und Charakterisierung von gruppenspezifischen Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA Aptameren wird vorgestellt. Die Anwendung von der ausgewählten Aptamer in einem elektrochemischen Aptasensor ist ebenfalls enthalten.
Abstract
Phthalsäure Acid Ester (PAEs) einer der wichtigsten Gruppen von persistenten organischen Schadstoffen. Die gruppenspezifische Erkennung von PAEs ist sehr erwünscht, aufgrund der schnellen Anbau von Artgenossen. DNA-Aptameren zunehmend als Erkennungselemente auf Biosensor Plattformen angewendet wurden, aber Auswahl Aptamere auf stark hydrophobe niedermolekularer Ziele, wie z. B. PAEs, wird selten berichtet. Diese Arbeit beschreibt eine Perle basierende Methode entwickelt, um gruppenspezifische DNA Aptameren, PAEs auswählen. Die Aminogruppe funktionalisiert Dibutyl Phthalat (DBP-NH2) wie das Anker-Ziel wurde synthetisiert und an den Epoxy-aktivierte Agarose-Perlen immobilisiert ermöglicht die Anzeige der phthalic Estergruppe an der Oberfläche der Immobilisierung Matrix und Daher ist die Auswahl der gruppenspezifischen Bindemittel. Wir entschlossen die Dissoziation Konstanten der Aptamer Kandidaten durch quantitative Polymerisation Kettenreaktion gepaart mit magnetische Trennung. Die relativen Affinitäten und Selektivität der Aptamere für andere PAEs wurden durch die wettbewerbsfähige Assays bestimmt, wo die Aptamer-Kandidaten der DBP-NH2 Pre begrenzt waren magnetische Beads angebracht und veröffentlicht, um den Überstand nach Inkubation mit die getesteten PAEs oder andere potenziellen störenden Substanzen. Die wettbewerbsfähigere Assay wurde angewendet, weil sie einen einfache Affinität Vergleich zwischen PAEs bereitgestellt, die keine funktionellen Gruppen für Oberfläche Immobilisierung hatte. Schließlich demonstriert die Herstellung eines elektrochemischen Aptasensor und benutzte es für Gromer und selektive Detektion von bis(2-ethylhexyl) Phthalat. Dieses Protokoll bietet Einblicke für die Aptamer-Entdeckung des anderen hydrophoben kleine Moleküle.
Introduction
Zusammen mit der rasanten wirtschaftlichen Entwicklung ist die Beschleunigung der Industrialisierung und Städtebau, Umweltbelastungen strenger als je zuvor. Typischen Umweltschadstoffen gehören Schwermetall-Ionen, Toxine, Antibiotika, Pestizide, endokrine Disruptoren und persistente organische Schadstoffe (POPs). Neben der Metall-Ionen und Giftstoffe, andere Schadstoffe sind kleine Moleküle, dass ganz oft bestehen aus einer Vielzahl von Artgenossen. Die giftigsten POPs zählen beispielsweise polychlorierte Biphenyle (PCB), polychlorierten Dibenzofuran (PCDFs), polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), polybromierten APEO Ether (PBDE), polychlorierten Dibenzo-p-Dioxin (PCDDs) und phthalic saure Ester (PAEs)1,2, die alle viele Artgenossen aus. Kleines Molekül Erkennung wurde vor allem durch Chromatographie/Mass Spectrometry-basierten Techniken wegen ihrer Vielfalt von Anwendungen3,4,5,6durchgeführt. Für vor-Ort-Erkennungen wurden Antikörper-basierten Methoden kürzlich entwickelten7,8,9. Da diese Methoden sehr spezifisch für eine bestimmte gleichartig sind, müssen mehrere Tests durchgeführt werden. Gravierender ist, dass die neuartige Kongenere wachsen so schnell, dass ihre Antikörper in der Zeit erzeugt werden können. Daher kann die Entwicklung von zielgruppenspezifischen Biosensoren, die insgesamt Level alle Artgenossen in einem Test zu überwachen eine unschätzbare Metrik zur Bewertung von Umweltbelastungen Status bereitstellen.
Vor kurzem wurden Nukleinsäure-Aptamere weithin als Erkennungselemente in verschiedenen Biosensoren Plattformen durch ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von Zielen, von Ionen und kleinen Molekülen an Proteine und Zellen10,11 erkennen angewendet ,12. Aptamere werden durch eine in-vitro- Methode namens systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX)13,14identifiziert. SELEX beginnt mit der zufällige synthetische Einzelstrang Oligonukleotid-Bibliothek, die ca. 1014-1015 Sequenzen enthält. Die Größe der zufälligen Bibliothek sorgt für die Vielfalt der RNA oder DNA-Kandidat Strukturen. Der typische SELEX-Prozess besteht aus mehrere Runden der Bereicherung bis die Bibliothek in Sequenzen mit hoher Affinität und Spezifität zum Ziel angereichert ist. Der endgültige angereicherte Pool dann sequenziert und die Dissoziation konstanten (K–d) und Selektivität gegen mögliche Störsubstanzen durch verschiedene Techniken wie z. B. bestimmt werden Filtern verbindlich, Affinitätschromatographie, Oberfläche Plasmon-Resonanz (SPR), etc. 15
Aufgrund der extrem schlechten Wasserlöslichkeit und Mangel an funktionellen Gruppen für Oberfläche Immobilisierung ist die Aptamer-Auswahl des POPs theoretisch schwierig. Die Entdeckung der Aptamere haben bedeutende Fortschritte für SELEX beschleunigt. Die Auswahl der gruppenspezifischen Aptamere für POPs wurde jedoch noch nicht gemeldet. Bisher wurden nur PCB-Bindung DNA Aptameren mit hoher Spezifität für eine bestimmte Artgenossen identifizierte16. PAEs werden hauptsächlich in Polyvinylchlorid Materialien, Wechsel Polyvinylchlorid aus einem harten Kunststoff zu einem elastischen Kunststoff, fungiert somit als Weichmacher eingesetzt. Einige PAEs als endokrine Disruptoren eingestuft wurden, können schwere Schäden verursachen, Leber- und Nierenfunktion, reduzieren die Beweglichkeit der männlichen Spermien und abnormen Spermien Morphologie und Hodenkrebs17führen kann. Verbindung- weder die gruppenspezifischen PAE-Bindung Aptamere sind berichtet worden.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine repräsentative Protokoll bieten für die Auswahl von gruppenspezifischen DNA Aptameren, stark hydrophobe kleine Moleküle wie PAEs, eine repräsentative Gruppe von POPs. Wir zeigen auch die Anwendung von der ausgewählten Aptamer für Umweltverschmutzung Erkennung. Dieses Protokoll bietet Beratung und Einblicke für die Aptamer-Entdeckung des anderen hydrophoben kleine Moleküle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein herausragender Vorteil von Aptameren ist, dass sie erkannt werden, durch die in-Vitro -Methode SELEX, während Antikörper über in Vivo Immunoreactions generiert werden. Daher können Aptamere mit gewünschten Spezifität durchdachte experimentellen Bedingungen ausgewählt werden, während Antikörper auf physiologischen Bedingungen beschränkt sind.
Um die Trennung der gebundenen Sequenzen von freien Sequenzen zu erleichtern, mehrere modifizierten SELEX vor kurzem beric…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung von der National Natural Science Foundation (21675112), Key-Projekt von Wissenschaft und Technik Plan von Peking Education Commission (KZ201710028027) und Yanjing Young Scholar Program der Capital Normal University.
Materials
| UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
| VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
| Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
| Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. – 7.11 |
| tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
| diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |
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