חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי
Summary
פרוטוקול כדי להפוך את הבחירה במבחנה אפיון של חומצה פתלית המיועדות לקבוצות אסתר-איגוד ה-DNA aptamers מוצג. היישום של aptamer שנבחר ב aptasensor אלקטרוכימי נכלל גם.
Abstract
חומצה פתלית והפרופסור אסטרים (פאיס) של הקבוצות הגדולות של מזהמים אורגניים מתמיד. זיהוי המיועדות לקבוצות פאיס רצוי מאוד עקב גידול מהיר של congeners. DNA aptamers הוחלו יותר ויותר כרכיבים זיהוי בפלטפורמות ביוסנסור, אך בחירת aptamers לעבר מטרות מולקולה קטנה מאוד הידרופוביות, כגון פאיס, לעתים נדירות דווח. עבודה זו מתאר שיטה המבוססת על חרוז תוכנן כדי לבחור קבוצה ספציפית aptamers ה-DNA אל פאיס. קבוצת אמינו functionalized dibutyl פתלאט (DBP-NH2) המטרה עוגן היה מסונתז, ותשמרו על החרוזים מופעל אפוקסי agarose, מאפשר את התצוגה של קבוצת אסתר phthalic על פני השטח של המטריצה הנייח, ו לכן הבחירה של קלסרים קבוצה ספציפית. אנחנו נקבע את קבועי דיסוציאציה של המועמדים aptamer על ידי תגובת שרשרת הפילמור כמותיים בשילוב עם הפרדה מגנטית. הזיקות היחסי ואת מידת הבררנות של aptamers אל פאיס אחרים נקבעו על ידי מבחני תחרותי, שבו המועמדים aptamer היו ותחום מראש ל DBP-NH2 המצורפת beads מגנטי, שוחרר תגובת שיקוע על דגירה עם פאיס שנבדקו או חומרים מפריעות פוטנציאליים אחרים. וזמינותו תחרותי הוחל משום שסיפקה השוואה נתיישב זיקה בין פאיס שהיה אין קבוצות פונקציונליות עבור משטח הנייח. לבסוף, אנו הפגינו הזיוף של aptasensor אלקטרוכימי, השתמשו בו על זיהוי העדינה, סלקטיבי של פתלאט bis(2-ethylhexyl). פרוטוקול זה מספק תובנות על גילוי aptamer של מולקולות קטנות הידרופוביות אחרות.
Introduction
יחד עם התפתחות כלכלית מהירה, האצה של ה תיעוש, הבנייה העירונית, זיהום סביבתי הוא חמור יותר מאי פעם. טיפוסי מזהמים סביבתיים כוללים יונים של מתכות כבדות, רעלים, אנטיביוטיקה, חומרי הדברה, משבשים האנדוקרינית ו מזהמים אורגניים מתמיד (אבא). מלבד יונים מתכתיים, רעלים, מזהמים אחרים הם מולקולות קטנות לעיתים קרובות מכילים מגוון רחב של congeners. לדוגמה, הטיילת הרעילים ביותר לכלול polychlorinated biphenyls (PCBs), פחמימנים ארומטיים polycyclic (PAHs), polybrominated biphenyl קטונים (PBDEs), dibenzo-p-דיוקסין polychlorinated (PCDDs), polychlorinated dibenzofuran (PCDFs), ו phthalic חומצה אסטרים (פאיס)1,2, אשר כולם מורכב congeners רבים. גילוי מולקולה קטנה בוצעה בעיקר על-ידי טכניקות מבוססות ספקטרומטר מסה/כרומטוגרפיה בשל מגוון של יישומים3,4,5,6. עבור גילויים באתר, נוגדן מבוססי שיטות לאחרונה היה מפותח7,8,9. עם זאת, מאז שיטות אלה הם מאוד ספציפי congener מסוימים, יש לבצע בדיקות מרובות. מה זה חמור יותר הוא כי הרומן congeners לגדול כל כך מהר, כי לא ניתן ליצור נוגדנים שלהם בזמן. לכן, ההתפתחות של קבוצה ספציפית ביולוגיים כדי לנטר את רמות סך כל congeners במבחן אחד עשוי לספק מדד לא בפז להערכת מצב זיהום סביבתי.
לאחרונה, חומצת גרעין aptamers נרחב הוחלו כרכיבים זיהוי של פלטפורמות שונות biosensing עקב שלהם יכולת זיהוי מגוון רחב של מטרות, יונים ומולקולות קטנות חלבונים ותאים10,11 ,12. Aptamers מזוהים באמצעות שיטה במבחנה בשם האבולוציה שיטתית של ליגנדים מאת העשרה מעריכית (SELEX)13,14. SELEX מתחיל עם הספרייה oligonucleotide אקראיים סינתטי לחוט אחד, אשר מכיל כ רצפים15 14-10 10. הגודל של הספרייה אקראי מבטיחה את המגוון של המבנים המועמד RNA או DNA. תהליך SELEX טיפוסי מורכב מספר סיבובים של העשרה עד הספרייה מועשר ברצפים עם זיקה גבוהה וספציפיות אל המטרה. מועשר בבריכה הסופי אז הוא רציף, ולסנן קבועי דיסוציאציה (דK) ואת סלקטיביות נגד פוטנציאל חומרים מפריעות נקבעים על-ידי טכניקות שונות כגון איגוד, כרומטוגרפיית זיקה משטח פלזמון תהודה (SPR), וכו ‘. 15
בשל מסיסות המים ירודה ביותר וחוסר קבוצות פונקציונליות עבור משטח הנייח, הבחירה aptamer של סבא קשה באופן תיאורטי. התקדמויות משמעותיות עבור SELEX יש speeded את הגילוי של aptamers. עם זאת, הבחירה של קבוצה ספציפית aptamers עבור סבא יש וטרם דווחו. עד כה, רק מחייב PCB DNA aptamers עם ירידה לפרטים גבוה עבור congener מסוימים כבר מזוהה16. פאיס משמשים בעיקר בחומרים פוליוויניל כלוריד, שינוי במבנהו מפלסטיק קשיח לפלסטיק גמיש, ובכך כסוכנות מרכך ומגמיש. כמה פאיס זוהו משבשים האנדוקרינית, יכול לגרום נזק חמור בכבד, תפקוד כליות, להפחית את תנועתיות הזרע הגברי, עלול לגרום סרטן האשכים17ומורפולוגיה זרע לא תקין. המתחם – וגם המיועדות לקבוצות PAE מחייב aptamers דווחו.
מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול ייצוגית לבחירת המיועדות לקבוצות aptamers דנ א כדי מאוד הידרופובי מולקולות קטנות כגון פאיס, קבוצה ייצוגית של אבא. אנחנו גם להוכיח את היישום של aptamer שנבחר לגילוי זיהום סביבתי. פרוטוקול זה מספק הדרכה ותובנות על גילוי aptamer של מולקולות קטנות הידרופוביות אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחד מהיתרונות aptamers יוצא מן הכלל הוא כי הם מזוהים באמצעות השיטה במבחנה SELEX, בעוד נוגדנים נוצרים באמצעות ויוו immunoreactions. לכן, ניתן לבחור aptamers עם ירידה לפרטים היעד הרצוי בתנאים ניסיוני מעוצב היטב, ואילו נוגדנים מוגבלים בתנאים פיזיולוגיים.
כדי להקל על ההפרדה של רצפי מאו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
. אנחנו אסירי תודה על תמיכה כספית של הטבע הקרן הלאומית למדע (21675112), מפתח הפרויקט בתכנית למדע וטכנולוגיה של בייג’ינג ועדת החינוך (KZ201710028027), Yanjing הצעיר המלומד תוכנית של הון רגיל אוניברסיטת…
Materials
| UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
| VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
| Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
| Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. – 7.11 |
| tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
| diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |
References
- Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
- Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
- Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
- Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
- Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
- Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
- Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
- Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
- Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
- Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
- Yin, X. -. B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
- Nguyen, V. -. T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
- Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
- Yang, K. -. A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
- Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
- Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
- Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
- Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
- Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
- Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
- Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
- Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
- Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
- Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
- Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
- Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
- Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
- Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
- Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
- Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
- Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
- Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
- Song, K. -. M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
- Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
- Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
- Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
- Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).
