フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用
Summary
生体外の選択グループ特定フタル酸エステル結合 DNA アプタマーのキャラクタリゼーションのためのプロトコルが表示されます。電気化学 aptasensor で選択したアプタマーのアプリケーションが含まれています。
Abstract
フタル酸エステル (パエス) は残留性有機汚染物質の主要なグループの一人。・ パエスのグループ固有の検出が同族体の急速な成長のために望ましい。DNA アプタマーは、ますますバイオ センサー プラットフォーム上の認識要素として適用されているが、パエスなどの高い疎水性小分子目標に向かって選択するアプタマーはほとんど報告します。この作業では、・ パエスに DNA アプタマーの探索グループ特定を選択するように設計ビーズ法について説明します。アミノ基修飾フタル酸ジブチル (DBP NH2) アンカー ターゲットを合成し、エポキシ活性化アガロース ビーズに固定化した、固定マトリックスの表面でフタル酸エステルのグループの表示を許可してしたがって、グループ固有のバインダーの選択。我々 は、磁気分離と結合の定量的重合連鎖反応によるアプタマー候補の解離定数を決定しました。相対的な親和性と選択性他のパエスにアプタマーの競争の試金によって定められた磁気ビーズを添付アプタマー候補あった DBP NH2限定事前どこと培養上清にリリーステスト ・ パエスまたは他の潜在的な妨害物質。競争の試金は、表面固定化のための機能グループがなかった・ パエスの安易な親和性の比較を提供されるために適用しました。最後に、我々 は電気化学 aptasensor の作製を実証し、bis(2-ethylhexyl) フタル酸の超高感度かつ選択的な検出のためにそれを使用します。このプロトコルは、他の疎水性小分子のアプタマー探索の洞察力を提供します。
Introduction
急速な経済発展に伴って、工業化と都市建設公害の加速は今までよりもより厳しいです。代表的な環境汚染物質は、重金属、毒素、抗生物質、農薬、内分泌攪乱物質、残留性有機汚染物質 (POPs) に含まれます。金属イオンおよび毒素のほか他の汚染物質が低分子化合物がかなり多くの場合は、同族の様々 な。たとえば、最も有毒なポップス、ポリ塩化ビフェニル (Pcb)、多環芳香族炭化水素 (PAHs)、ポリ臭化ビフェニル エーテル (PBDEs)、ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン (ダイオキシン類)、ポリ塩化ジベンゾ フラン (濃度)、フタル酸と酸エステル (パエス)1、2、すべて多くの同族体から成っています。小分子の検出は、アプリケーション3,4,5,6の多様性のためのクロマトグラフィー/質量分析法を用いたテクニックで主に行われています。オンサイト検出の抗体を用いた方法は最近開発された7,8,9をされています。ただし、これらのメソッドは特定の同族体に非常に特有なので、複数のテストを実行する必要があります。深刻なは新規の同族が非常に高速にその抗体を生成できないことを成長します。したがって、1 つのテストですべての同族体のレベルの合計を監視するグループ固有のバイオ センサーの開発は環境汚染状況を評価するため非常に貴重な指標を提供可能性があります。
最近、核酸アプタマーは広く様々 なイオンと蛋白質と細胞10,11 小分子化合物からのターゲットを認識の彼らの能力のための様々 なバイオセンシング プラットフォームの認識要素として適用されています。 ,12。アプタマーは、指数関数的濃縮 (SELEX)13,14によって配位子の系統進化と呼ばれる体外法によって識別されます。SELEX から始まるランダム合成一本鎖オリゴヌクレオチド ライブラリは、約 10 の14-1015シーケンスが含まれています。ランダムなライブラリのサイズは、RNA または DNA 候補構造の多様性を保証します。SELEX の典型的なプロセスは、ライブラリが高い親和性と特異性をターゲットのシーケンスで濃縮されてまで濃縮の複数のラウンドで構成されます。最終的な豊かなプールがシーケンスをサポートしと解離定数 (Kd) と妨害物質などさまざまな手法によって決定されます潜在的な選択性フィルター、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、表面のバインディングプラズモン共鳴 (SPR)、等。15
非常に貧しい人々 の水の溶解度と表面固定化機能群の不足、Pop のアプタマー選択は理論的に難しい。SELEX にとって重要な進歩がアプタマーの探索を高速化します。しかし、Pop のグループ固有のアプタマーの選択はまだ報告されていません。これまでのところ、特定の同族体の高度だけ基板結合 DNA アプタマーの探索は、識別された16をされています。パエスはポリ塩化ビニール材料、硬質プラスチックから、弾塑性解析、可塑剤として作用するポリ塩化ビニルを変更することで主に使用されます。いくつかのパエス内分泌かく乱物質として識別されている、深刻な損傷を引き起こすことができる肝臓と腎臓機能、男性の精子の運動性の軽減、精子形態の異常および精巣癌17があります。化合物 – もグループ固有 PAE バインディング アプタマーが報告されています。
この作業の目的は、ポップスの代表的なグループ ・ パエスといった高疎水性の小さな分子に DNA アプタマーの探索グループ特定を選択するための代表的なプロトコルを提供するためにです。また環境汚染検出のため選択したアプタマーのアプリケーションを示します。このプロトコルは、他の疎水性小分子のアプタマー探索の指導と洞察力を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
アプタマーの顕著な利点の 1 つは抗体が生体内で免疫反応を介して生成された SELEX、体外法によって識別されます。したがって、アプタマーは抗体が生理的条件に限定しているに対し、適切に設計された実験条件下で目的のターゲット特異性と選択できます。
無料シーケンスからバインドされたシーケンスの分離を容易にするいくつかの変更された SELEX 最?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
国家自然科学基金 (21675112)、北京教育委員会 (KZ201710028027) と燕若い学者プログラムの首都師範大学の科学技術計画のキー プロジェクトから財政支援に感謝しております。
Materials
| UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
| DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
| VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
| Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
| Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
| Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
| PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
| Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
| UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
| Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. – 7.11 |
| tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
| diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |
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