En protokoll for i vitro valg og karakterisering av gruppespesifikke phthalic syre ester-bindende DNA aptamers presenteres. Anvendelsen av den valgte aptamer i en elektrokjemisk aptasensor er også inkludert.
Phthalic syre estere (PAEs) areone av de store gruppene av Persistente organiske miljøgifter. Gruppespesifikke påvisning av PAEs er svært ønskelig på grunn av rask vokser kongenere. DNA aptamers har blitt stadig mer brukt som anerkjennelse elementer på biosensor plattformer, men velge aptamers mot svært hydrofobe små molekyl mål som PAEs, er sjelden rapportert. Dette verket beskriver en perle-basert metode for Velg gruppespesifikke DNA aptamers til PAEs. Gruppen amino functionalized Dibutylftalat (DBP-NH2) som anker målet ble syntetisert og immobilisert på epoxy-aktivert agarose perler, at visningen av gruppen phthalic ester på overflaten av immobilisering matrise, og Derfor valg av gruppespesifikke bindemidler. Vi bestemt dissosiasjon konstantene i aptamer kandidater av kvantitative polymerisasjon kjedereaksjon kombinert med magnetiske separasjon. Den relative slektskap og selektivitet av aptamers til andre PAEs ble fastsatt av de konkurransedyktige analyser, der aptamer kandidatene var pre avgrenset til DBP-NH2 knyttet magnetiske perler og frigitt til nedbryting på inkubasjon med de testet PAEs eller andre potensielle forstyrrende stoffer. Konkurransedyktige analysen ble brukt fordi det ga en lettvinte affinitet sammenligning mellom PAEs som hadde ingen funksjonelle grupper for overflate immobilisering. Endelig vi viste fabrikasjon av en elektrokjemisk aptasensor og brukte den for ultrasensitive og selektiv påvisning av bis(2-ethylhexyl) ftalat. Denne protokollen gir innsikt for aptamer å andre hydrofobe små molekyler.
Rask økonomisk vekst er akselerasjon av industrialisering og urbane konstruksjon, miljøforurensning mer alvorlig enn noensinne. Typisk miljøgifter inkluderer heavy metall ioner, toksiner, antibiotika, plantevernmidler, endokrine disruptors og Persistente organiske miljøgifter (kommer). Dessuten metall ioner og giftstoffer, andre miljøgifter er små molekyler at ganske ofte består av en rekke kongenere. De mest giftige dukker inkluderer for eksempel polyklorerte bifenyler (PCB), Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH), polybromert biphenyl etere (PBDEs), polyklorerte dibenzo-p-dioksin (PCDDs), polyklorerte dibenzofuran (PCDFs), og phthalic Acid estere (PAEs)1,2, som består av mange kongenere. Små molekyl gjenkjenning er hovedsakelig utført av Ture/mass massespektrometri-baserte teknikker på grunn av sitt mangfold programmer3,4,5,6. For på stedet detektorer, har antistoff-baserte metoder nylig vært utviklet7,8,9. Men siden disse metodene er svært spesifikke for en bestemt congener, må flere tester utføres. Hva er mer alvorlig er at romanen kongenere vokser så fort at deres antistoffer ikke kan genereres i tid. Derfor kan utviklingen av gruppespesifikke biosensors å overvåke den totale nivået av alle kongenere i en test gi en uvurderlig beregning for å vurdere miljøforurensning status.
Nylig har nukleinsyre aptamers vært mye brukt som anerkjennelse elementer i ulike biosensing plattformer på grunn av deres evne til å gjenkjenne en rekke mål, fra ioner og små molekyler proteiner og celler10,11 ,12. Aptamers er identifisert gjennom en i vitro metode kalt systematisk utviklingen av ligander av eksponentiell berikelse (SELEX)13,14. SELEX begynner med tilfeldig syntetiske enkelt tråd oligonucleotide biblioteket, som inneholder ca 1014-1015 sekvenser. Størrelsen på tilfeldig biblioteket sikrer mangfoldet av RNA eller DNA kandidat strukturer. Typisk SELEX prosessen består av flere runder berikelse til biblioteket er beriket i sekvenser med høy affinitet og spesifisiteten til målet. Siste beriket bassenget er deretter sekvensielt og dissosiasjon konstanter (Kd) og selektivitet mot potensielle forstyrrende stoffer bestemmes av ulike teknikker som filtrerer bindende, affinitet Ture, overflate Plasmon resonans (SPR), etc. 15
Svært dårlig vannløselighet og mangel på funksjonelle grupper for overflate immobilisering er aptamer utvalget av dukker teoretisk vanskelig. Betydelige fremskritt for SELEX har fart oppdagelsen av aptamers. Men blitt valg av gruppespesifikke aptamers for dukker ikke har rapportert. Så langt har bare PCB-bindende DNA aptamers med høy spesifisitet for en viss congener vært identifisert16. PAEs brukes hovedsakelig i polyvinylklorid materialer, endre polyvinylklorid fra en hard plast til en elastisk plast, dermed fungerer som en plasticizer. Noen PAEs har blitt identifisert som endokrine disruptors, kan forårsake alvorlig skade leveren og nyrefunksjon, redusere motilitet i mannlige sperm, og kan føre til unormal sperm morfologi og testikkelkreft17. Verken sammensatte- eller gruppespesifikke PAE-bindende aptamers har rapportert.
Målet med dette arbeidet er å gi en representant protokoll for å velge gruppespesifikke DNA aptamers til svært hydrofobe små molekyler som PAEs, en representant gruppe dukker. Vi viser også anvendelsen av den valgte aptamer for gjenkjenning av miljøforurensning. Denne protokollen gir veiledning og innsikt for aptamer å andre hydrofobe små molekyler.
En fremragende fordelen med aptamers er at de er identifisert gjennom metoden i vitro SELEX, mens antistoffer genererte via i vivo immunoreactions. Derfor kan aptamers velges med ønsket mål spesifisitet under velutformede eksperimentelle forhold, mens antistoffer er begrenset til fysiologiske forhold.
For å lette separasjon av bundet sekvenser fra frie sekvenser, flere modifisert SELEX nylig er rapportert, som kapillær geleelektroforese30, microflu…
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for økonomisk støtte fra National Natural Science Foundation (21675112), Key prosjektet av vitenskap og teknologi plan Beijing utdanning provisjon (KZ201710028027) og Yanjing ung forsker Program av hovedstaden Normal University.
UV-2550 | Shimadzu,Japan | protocol, section 3.8.2 | |
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200 | BIO-RAD | section 3.5.1.2 and 3.5.2 | |
C1000 Touch | BIO-RAD | section 5.3.6 and 6.3 | |
VMP3 multichannel potentiostat | Bio-Logic Science, Claix, France | section 7.4,7.8 and 7.11 | |
Epoxy-activated Sepharose 6B | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 10220020 | argarose beads, section 2.3 and 3.3 |
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads | Invitrogen, USA | 420420 | magnetic beads,section 5.2. and 5.3 |
Premix Taq Hot Start Version | Takara,Dalian,China | R028A | polymerase, section 3.5.1.1 |
PARAFILM Sealing Membrane | Bemis, USA | PM-996 | section 3.6.5 |
Lambda Exonuclease | Invitrogen, USA | EN0561 | section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider. |
Dr. GenTLE Precipitation Carrier |
Takara,Dalian,China | 9094 | section 3.6.2 and 3.8.1 |
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | section 4.2 |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | Invitrogen, USA | 1811838 | nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5 |
SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5 |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | section 5.2.1 |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Invitrogen, USA | CAS: 25952-53-8 | section 5.2.2 |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | section 5.2.3 |
mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | section 7.7 |
Gold electrode | Shanghai Chenhua | CHI101 | section 7.4. – 7.11 |
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | section 7.5 |
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | section 7.7 |
diethylhexyl phthalate (DEHP) | National Institute of Metrology, China | CAS: 117-81-7 | section 7.11 |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | non-ionic surface active agent |
PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4 |