الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط التحليل بتشتت الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي
Summary
ويصف هذا البروتوكول توليف الجزيئات المغناطيسية وتقييم خصائصها ربط الحمض النووي عن طريق نثر الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي. يركز هذا الأسلوب على رصد التغيرات في حجم الجسيمات، وعلى بوليديسبيرسيتي والرئيسية إمكانات زيتا لسطح الجسيمات التي تلعب دور في ملزمة لمواد مثل الحمض الريبي النووي.
Abstract
عزل الحمض النووي المغناطيسي الجسيمات باستخدام حقل ذو أهمية فائقة في بحوث التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. ويصف هذا البروتوكول تقييم جزيئات الحمض النووي المغناطيسي ملزمة عن طريق نثر الضوء الحيوي (DLS) وتشتت الضوء الغرواني الكهربي (ELS). تحليل حسب DLS توفر معلومات قيمة عن الخصائص الفيزيائية للجسيمات بما في ذلك حجم الجسيمات، بوليديسبيرسيتي، وزيتا المحتملة. ويصف هذا الأخير تهمة السطحية للجسيمات التي تلعب دوراً رئيسيا في الربط الكهربائي من مواد مثل الحمض النووي. وهنا يستغل تحليل مقارن التعديلات الكيميائية ثلاثة جسيمات نانوية والمجهرية الدقيقة وتأثيراتها على الحمض النووي ملزم وشطف. التعديلات الكيميائية التي تشعبت بولييثيلينيميني، ويجري التحقيق في تريثوكسيسيلاني إيثيل أورثوسيليكاتي و (3-أمينوبروبيل). لما الحمض النووي المعارض شحنة سالبة، فمن المتوقع أن تنخفض إمكانيات زيتا لسطح الجسيمات عند ربط الحمض النووي. وينبغي تشكيل المجموعات تؤثر أيضا على حجم الجسيمات. من أجل التحقيق في كفاءة هذه الجسيمات في العزلة وشطف الحمض النووي، مختلطة الجسيمات مع الحمض النووي في انخفاض الأس الهيدروجيني (~ 6) وقوة الأيونية عالية وجفاف البيئة. تغسل الجسيمات في المغناطيس وثم الحمض النووي هو الوتيد بالمخزن المؤقت تريس-HCl (pH = 8). ويقدر عدد نسخ الحمض النووي باستخدام الكمية البلمرة المتسلسل (PCR). تقييم ومقارنة إمكانات زيتا وحجم الجسيمات، بوليديسبيرسيتي وبيانات PCR الكمي. دائرة الأراضي والمساحة هو الثاقبة ودعم أسلوب التحليل الذي يضيف منظورا جديداً لعملية فحص جسيمات لعزل الحمض النووي.
Introduction
عزل الحمض النووي إحدى الخطوات الأكثر أهمية في مجال البيولوجيا الجزيئية. تطوير أساليب استخراج الحمض النووي تأثيراً كبيرا على الناشئة مجالات علم الجينوم وميتاجينوميكس والتخلق وترانسكريبتوميكس. وهناك مجموعة واسعة من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية لعزل الحمض النووي بما في ذلك الطبية (أدوات الطب الشرعي/التشخيص وتنبؤاتها المؤشرات الحيوية)، والتطبيقات البيئية (الجينومية التنوع البيولوجي وانتشار مسببات المرض والمراقبة). كان هناك طلب متزايد لتنقية وعزل الحمض النووي من مواد مختلفة، وفي مستويات مختلفة مثل الدم، البول، والتربة، والخشب، وأنواع أخرى من العينات. 1 , 2 , 3 , 4
جزيئات نانو والصغيرة الحجم مناسبة لعزل الحمض النووي بسبب تلك المساحة السطحية العالية، ولا سيما عندما أنهم يمكن أن تكون معطلة بحقل مغناطيسي. الخصائص الفيزيائية للجسيمات، مثل الحجم أو التهمة، يمكن أن تؤثر إلى حد كبير قدرتها على ربط الجزيئات الحيوية المستهدفة. 5 لزيادة تعزيز ربط الجزيئات الحيوية واستقرار الجزيئات، يمكن أن تستخدم مختلف التعديلات الكيميائية (طلاء السطح). العديد من الاستراتيجيات المختلفة لربط تصنف وفقا للتفاعلات التساهمية وغير التساهمي. 6 حجم الجسيمات يؤثر تأثيراً مباشرا على خصائصها المغناطيسية، بينما يمكن أن تكون مصممة تكوين الجسيمات بإدراج معدنية أو سبائك أو غيرها من المواد التي يمكن أن تؤثر في كثافة، المسامية، وسطح. وهناك 7 لا طريقة يمكن الاعتماد عليها لقياس تهمة السطحية لجزيئات صغيرة. بدلاً من ذلك، يمكن قياس القدرة الكهربائية في الطائرة المتأخرة (بعض المسافة بعيداً عن سطح نانوحبيبات). 8 هذه القيمة يسمى زيتا المحتملة وهو أداة قوية التي تستخدم عادة للتقييم لنانو-ويمثل الاستقرار عن طريق دائرة الأراضي والمساحة. 9 نظراً لقيمته اعتماداً كبيرا ليس فقط على درجة الحموضة وقوة الأيونية البيئة المشتتة، ولكن أيضا على الخصائص السطحية للجسيمات، فإنه يمكن أيضا أن تثبت التغييرات في هذا السطح الناجمة عن التفاعل بين الجسيمات وجزيء من الفائدة. 10
من ناحية أخرى، تحدث بنية الحمض النووي في ظروف المجففة (نموذج أ-الحمض النووي) المعارض والتشكلات المضغوطة التي تيسر لها هطول الأمطار (تجميع) عند مقارنة إلى عادة شكل ب-الحمض النووي. كهرباء (الأيونية والسندات ح) هي القوى الرئيسية السيطرة على ربط الحمض النووي للمواد الأخرى بسبب ما فوسفات ستيريكالي موجوداً وقواعد النيتروجين (لا سيما جوانين). 7 , 10
في هذا العمل، ويتم تحليل التعديلات الكيميائية الممثل ثلاثة جسيمات نانوية مغناطيسية والمجهرية الدقيقة (الشكل 1A). يتم وصف أسلوب التوليف والتعديل الكيميائي لجسيمات نانوية والمجهرية الدقيقة. حل ملزم، أن اتفاقات المبادئ النظرية لترسيب الحمض النووي (درجة الحموضة، القوة الأيونية، والجفاف)، يستخدم لتقييم الحمض النووي ملزم وشطف. يتم استخدام PCR الكمي لتقييم كفاءة شطف الحمض النووي من جسيمات نانوية الممثل والمجهرية الدقيقة (الشكل 1B). حجم الجسيمات ومؤشر بوليديسبيرسيتي وزيتا المحتملة هي المعالم الهامة التي يتم استخدامها لتصور التغيرات الفيزيائية التي تحدث على سطح الجسيمات (الشكل 1). من المهم التأكيد على أن وصف السطح المغناطيسي الجسيمات الكيميائية. وبينما كانت هذه الخطوة خارج نطاق هذا البروتوكول، يمكن تطبيق العديد من التقنيات الحديثة للتحقيق في كفاءة التعديلات الكيميائية. 11 , 12 , 13 , 14 فورييه تحويل مطيافية الأشعة تحت الحمراء (FTIR) يمكن استخدامها لتقييم طيف الأشعة تحت الحمراء لسطح الجسيمات وذلك مقارنة بطيف المعدلات الكيميائية الحرة. مطيافية إلكترون الأشعة السينية (XPS) هو تقنية أخرى يمكن استخدامها لتحديد تكوين عنصري من سطح المادة. يمكن استخدام أساليب أخرى الكهروكيميائية والمجهرية والطيفية تسليط الضوء على نوعية التوليف الجسيمات. ويبرز هذا العمل منظورا جديداً لتحليل الحمض النووي المغناطيسي الجسيمات التفاعل عن طريق دائرة الأراضي والمساحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، كانت المبادئ النظرية التي تشرح الحمض النووي ملزم بالجسيمات المغناطيسية عن طريق زيتا المحتملة تحت السؤال. ويصف البروتوكول التوليف وتعديل جسيمات نانوية مغناطيسية والمجهرية الدقيقة. كما يتم وصف طريقة لإعداد حل التحكم وربط الحمض النووي. تظهر هاتان الاستراتيجيتان هنا لفح?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
من المسلم به إلى حد كبير الدعم المالي المقدم من مؤسسة العلوم التشيكية (مشروع GA CR 17-12816S) وعام 2020 سيتيك (LQ1601).
Materials
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
- Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
- Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
- Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
- Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
- Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
- Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
- Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
- Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
- Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
- Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
- Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
- Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
- Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
