डीएनए-चुंबकीय कण गतिशील और Electrophoretic प्रकाश कैटरिंग द्वारा बाध्यकारी विश्लेषण
Summary
इस प्रोटोकॉल गतिशील और electrophoretic प्रकाश कैटरिंग के माध्यम से चुंबकीय कणों और उनके डीएनए बाध्यकारी गुणों के मूल्यांकन के संश्लेषण का वर्णन करता है । इस विधि कण आकार में परिवर्तन की निगरानी पर ध्यान केंद्रित, उनके polydispersity और कण सतह के जीटा क्षमता जो ऐसी डीएनए के रूप में सामग्री के बंधन में प्रमुख भूमिका निभाते हैं ।
Abstract
डीएनए के अलगाव चुंबकीय कणों का उपयोग जैव प्रौद्योगिकी और आणविक जीवविज्ञान अनुसंधान में उच्च महत्व का एक क्षेत्र है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन है डीएनए के मूल्यांकन-चुंबकीय कणों के माध्यम से बाध्यकारी गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) और electrophoretic प्रकाश कैटरिंग (ELS) । DLS द्वारा विश्लेषण कण आकार, polydispersity, और जीटा क्षमता सहित कणों के भौतिक गुणों पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है । बाद कण जो इस तरह के डीएनए के रूप में सामग्री के बंधन इलेक्ट्रोस्टैटिक में प्रमुख भूमिका निभाता है की सतह प्रभारी का वर्णन । यहाँ, एक तुलनात्मक विश्लेषण नैनोकणों और microparticles के तीन रासायनिक संशोधनों और डीएनए बाइंडिंग और रेफरेंस पर उनके प्रभाव का दोहन करता है । branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate और (3-aminopropyl) triethoxysilane द्वारा रासायनिक संशोधनों की जांच की जाती है । के बाद से डीएनए एक नकारात्मक आरोप दर्शाती है, यह उंमीद है कि जीटा कण की सतह के संभावित डीएनए के बंधन पर कम हो जाएगा । क्लस्टर के गठन भी कण आकार को प्रभावित करना चाहिए । आदेश में अलगाव और डीएनए के रेफरेंस में इन कणों की दक्षता की जांच करने के लिए, कणों कम पीएच (~ 6), उच्च ईओण ताकत और निर्जलीकरण वातावरण में डीएनए के साथ मिश्रित कर रहे हैं । कणों चुंबक पर धोया जाता है और फिर डीएनए Tris-एचसीएल बफर (पीएच = 8) द्वारा eluted है । मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग कर डीएनए कॉपी नंबर अनुमानित है । जीटा संभावित, कण आकार, polydispersity और मात्रात्मक पीसीआर डेटा मूल्यांकन और तुलना कर रहे हैं । DLS विश्लेषण की एक व्यावहारिक और समर्थन विधि है कि डीएनए अलगाव के लिए कणों की स्क्रीनिंग की प्रक्रिया के लिए एक नया परिप्रेक्ष्य कहते है ।
Introduction
डीएनए अलगाव आणविक जीवविज्ञान में सबसे आवश्यक चरणों में से एक है । न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण तरीकों के विकास जीनोमिक्स, metagenomics, epigenetics, और transcriptomics के उभरते क्षेत्रों पर काफी प्रभाव पड़ता है । वहां चिकित्सा सहित डीएनए अलगाव के लिए जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है (फोरेंसिक/नैदानिक उपकरण और शकुन), और पर्यावरण अनुप्रयोगों (metagenomic जैव विविधता, रोगज़नक़ प्रसार, और निगरानी) । विभिन्न सामग्रियों से डीएनए को शुद्ध करने और अलग करने और विभिन्न तराजू जैसे रक्त, मूत्र, मिट्टी, लकड़ी, और अन्य प्रकार के नमूनों में मांग बढ़ रही है । 1 , 2 , 3 , 4
नैनो और सूक्ष्म आकार के कणों उनके उच्च सतह क्षेत्र और विशेष रूप से जब वे एक चुंबकीय क्षेत्र द्वारा मैटीरियल किया जा सकता है के कारण डीएनए अलगाव के लिए उपयुक्त हैं । कणों के भौतिक गुण, जैसे आकार या प्रभारी, बहुत अपने लक्ष्य को प्रभावित करने की क्षमता को प्रभाव कर सकते है अणुओं । 5 और जैव अणुओं के बंधन को बढ़ाने के लिए और कणों को स्थिर करने के लिए, विभिंन रासायनिक संशोधनों (सतह कोटिंग्स) का उपयोग किया जा सकता है । कई बाध्यकारी के लिए विभिंन रणनीतियों आबंध और गैर आबंध बातचीत के अनुसार वर्गीकृत कर रहे हैं । 6 कण का आकार सीधे उनके आकर्षण गुणों को प्रभावित करता है, जबकि कण संरचना धातु, मिश्र धातु या अंय सामग्री है कि इसके घनत्व, porosity, और सतह को प्रभावित कर सकते है के निगमन द्वारा सिलवाया जा सकता है । 7 वहां छोटे कणों की सतह प्रभारी उपाय करने के लिए कोई विश्वसनीय तरीका है । इसके बजाय, फिसल विमान में बिजली की क्षमता (कुछ दूरी nanoparticle सतह से दूर) मापा जा सकता है । 8 इस मूल्य जीटा क्षमता कहा जाता है और यह एक शक्तिशाली उपकरण है कि आम तौर पर नैनो के मूल्यांकन के लिए प्रयोग किया जाता है और DLS के माध्यम microparticle स्थिरता है । 9 के बाद से अपने मूल्य अत्यधिक न केवल पीएच और ईओण dispersing पर्यावरण की ताकत पर निर्भर है, लेकिन यह भी कणों की सतह विशेषताओं पर, यह भी इस के बीच बातचीत की वजह से सतह में परिवर्तन साबित कर सकते है कणों और ब्याज के अणु । 10
दूसरी ओर, निर्जलित परिस्थितियों में डीएनए संरचना (एक-डीएनए फार्म) संकुचित अनुरूपता प्रदर्शित करता है कि इसकी वर्षा (एकत्रीकरण) की सुविधा जब सामांयतः होने बी डीएनए फार्म की तुलना में । इलेक्ट्रोस्टैटिक (ईओण और एच बांड) प्रमुख उनके sterically सुलभ फॉस्फेट और नाइट्रोजन कुर्सियां (विशेष रूप से guanine) के कारण अंय सामग्री के लिए डीएनए के बंधन को नियंत्रित बलों रहे हैं । 7 , 10
इस काम में चुंबकीय नैनोकणों और microparticles के तीन प्रतिनिधि रासायनिक संशोधनों (चित्र 1a) का विश्लेषण कर रहे हैं । नैनोकणों और microparticles के संश्लेषण और रासायनिक संशोधन की विधि बताई गई है. एक बाध्यकारी समाधान, कि डीएनए वर्षा के सैद्धांतिक सिद्धांतों के लिए समझौते (पीएच, ईओण की शक्ति, और निर्जलीकरण), डीएनए बाध्यकारी और रेफरेंस का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । मात्रात्मक पीसीआर प्रतिनिधि नैनोकणों और microparticles (चित्र 1b) से डीएनए की रेफरेंस दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कण आकार, polydispersity सूचकांक, और जीटा क्षमता महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि भौतिक परिवर्तन है कि कण की सतह पर हो कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है (चित्रा 1C) । यह चुंबकीय कण की सतह के रासायनिक लक्षण वर्णन पर जोर महत्वपूर्ण है । हालांकि यह कदम इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर था, कई आधुनिक तकनीकों को रासायनिक संशोधनों की दक्षता की जांच के लिए लागू किया जा सकता है । 11 , 12 , 13 , 14 रूपान्तर परिवर्तन अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (स्विचेज) कण सतह के अवरक्त स्पेक्ट्रम का मूल्यांकन करने और इसे मुक्त रासायनिक संशोधक के स्पेक्ट्रम से तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक्स-रे photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS) एक और तकनीक है कि सामग्री की सतह की मौलिक संरचना की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अन्य विद्युत, सूक्ष्म और स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों का प्रयोग कण संश्लेषण की गुणवत्ता पर प्रकाश डालता है । यह काम डीएनए का विश्लेषण करने के लिए एक नया परिप्रेक्ष्य-चुंबकीय कणों DLS के माध्यम से बातचीत पर प्रकाश डाला गया ।
Protocol
1. चुंबकीय नैनोकणों संश्लेषण साइट्रेट के साथ स्थिर चुंबकीय नैनोकणों का संश्लेषण (MNPs) Add 20 mmol of FeCl 3 & #8729; 6H 2 ओ (५.४०६ ग्राम) और 10 mmol के FeCl 2 & #8729; 4H 2 O (१.९८८ ग्राम) में 20 एमएल का deoxygenated डबल आ…
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, सैद्धांतिक सिद्धांत है कि डीएनए की व्याख्या जीटा क्षमता के माध्यम से चुंबकीय कणों को बाध्यकारी सवाल के तहत किया गया । प्रोटोकॉल संश्लेषण और चुंबकीय नैनोकणों और microparticles के संशोधन का वर?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
चेक विज्ञान फाउंडेशन (परियोजना गा सीआर 17-12816S) और CEITEC २०२० (LQ1601) द्वारा वित्तीय सहायता बहुत स्वीकार किया है ।
Materials
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
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