リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化
Summary
翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々 は出芽酵母出芽酵母における翻訳の定量分析のための高スループット方法をについて説明します。
Abstract
MRNA のタンパク質への翻訳は、規制のいくつかの層を含む複雑なプロセスです。MRNA 転写の変化蛋白質合成に変更を反映するが、多くの例外を観察されているとしばしば見なされます。最近では、リボソーム プロファイル (またはリボ Seq) と呼ばれる手法は、mRNA の領域はタンパク質とゲノムのレベルで翻訳の定量化に変換されます、精度の高い識別ができる強力な方法として浮上しています。ここでは、出芽酵母リボ Seq を使用して翻訳のゲノムワイドな定量化のための一般的なプロトコルを提案する.また、同時に何千もの同じサンプルの mrna の翻訳効率を定量化し、比較実験への応答でこれらのパラメーターの変更を可能にリボ Seq データ mRNA 豊富な測定と組み合わせること操作または異なる生理学的状態に。ヌクレアーゼ消化、ショ糖勾配分画法によるフット プリントとはそのままリボソーム複合体の分離および DNA ライブラリの準備を使用して適切なと共にディープ シーケンスのリボソーム足跡の生成のための詳しいプロトコルについて述べる生体内で翻訳の正確な分析を確保するために必要な品質を制御します。
Introduction
mRNA の翻訳は、タンパク質発現の調節に重要な役割を果たしている細胞の基本的なプロセスの 1 つです。したがって、mRNA の翻訳は、さまざまな内部および外部生理的刺激1,2への応答では厳重します。ただし、翻訳制御機構のまま流。ここでは、プロファイリング ・ リボソームで翻訳出芽酵母におけるゲノム定量化のプロトコルについて述べる.リボソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、研究し、細胞の異なる条件の下で特定の Mrna の翻訳を定量化することです。このテクニックは、ゲノム全体のリボソーム占有率を定量的に解析する次世代シーケンスを使用して、タンパク質合成生体内単一コドン解像度3,4の率を監視できます。現在、このメソッド タンパク質翻訳のレベルを測定する最も先進的な手段を提供して他の現在利用可能な技術、マイクロ アレイなどによって明らかにすることができない情報を提供する便利な検出ツールをあると証明したか翻訳の状態配列解析 (TSAA) 5。リボソームのプロファイリングと並進出力のトラン スクリプト レベルでそれらの変更内容をレポートとしてそれはまた他の方法と比べて多くの高い感度を提供します。
このアプローチは、リボソームで保護された mRNA の断片3のディープ シーケンスに基づいています。リボゾームの保護タンパク質翻訳中 〜 (足跡と呼ばれる) mRNA の6の 28 の nt 部分。リボソームで保護されたフラグメントのシーケンスを決定すると、リボ Seq は翻訳 mRNA にリボソームの位置をマップし、積極的にタンパク質3,7と訳されるが mRNA のどの領域を確認できます。さらに、特定の mRNA のコピーに揃える足跡の数をカウントすることによって mRNA の翻訳定量的測定できます。
リボソーム保護断片を分離するためにセル lysates は当初リボヌクレアーゼ消化続いてリボソームを失速する翻訳阻害剤と扱われます。無料の mRNA およびリボゾームによって保護されていない翻訳 Mrna の部分はリボヌクレアーゼによって低下するのに対し、フット プリントとはそのままリボソーム複合体を浄化することによって mRNA のリボソーム保護断片を回復できます。これらの mRNA の足跡は cDNA ライブラリに変換し、ディープ シーケンス (図 1) によって分析します。リボソームのプロファイリングに並行して、そのまま mRNA を同じサンプルから抽出してシーケンスします。リボ Seq mRNA 豊富な測定と識別される翻訳のレベルを比較すると、特にアップ- または調整される翻訳のレベルでは、ある遺伝子を識別し、ゲノム全体のレベルでの mRNA の翻訳の効率を計算できます。この資料で説明されているプロトコルはイースト菌の特定が、他のシステムでリボ Seq プロトコルを確立しようとして、研究者の役に立つまたする必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
リボ Seq アプローチは、mRNA 翻訳体内でゲノムのレベル3の解析のための強力な技術として浮上しています。シングル コドン解像度変換を監視でき、この手法を使用して研究は翻訳制御の私達の理解に貢献しています。その利点にもかかわらずリボ Seq いくつか制限があります。リボソーム RNA (rRNA) フラグメントは、リボソーム保護足跡リボ Seq 実験9<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事は健康補助金 AG040191 と VML に AG054566 研究機構によって支えられました。VML が加齢医学研究のためのアメリカ連合から遠く研究助成受信者間に調査しました。
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
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