Ribosome profiling द्वारा नवोदित खमीर में अनुवाद के जीनोम चौड़ा ठहराव
Summary
अनुवाद विनियमन प्रोटीन बहुतायत के नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यहां, हम नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiaeमें अनुवाद के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक उच्च प्रवाह विधि का वर्णन ।
Abstract
प्रोटीन में mRNA का अनुवाद एक जटिल विनियमन के कई परतों को शामिल प्रक्रिया है । यह अक्सर माना जाता है कि mRNA प्रतिलेखन में परिवर्तन प्रोटीन संश्लेषण में परिवर्तन को प्रतिबिंबित, लेकिन कई अपवाद देखा गया है । हाल ही में, एक तकनीक ribosome profile बुलाया (या राइबो-Seq) एक शक्तिशाली तरीका है कि पहचान की अनुमति देता है के रूप में उभरा है, उच्च सटीकता के साथ, जो mRNA के क्षेत्रों प्रोटीन और अनुवाद के जीनोम में ठहराव व्यापक स्तर पर अनुवाद कर रहे हैं । यहां, हम उभरते खमीर में राइबो-Seq का उपयोग अनुवाद के जीनोम चौड़ा ठहराव के लिए एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, संयोजन राइबो-mRNA बहुतायत माप के साथ Seq डेटा हमें एक साथ एक ही नमूना में mRNA टेप के हजारों की अनुवाद क्षमता मात्रा और प्रयोगात्मक के जवाब में इन मापदंडों में परिवर्तन की तुलना करने के लिए अनुमति देता है जोड़तोड़ या अलग शारीरिक राज्यों में । हम ribosome पैरों के nuclease पाचन का उपयोग कर, बरकरार ribosome के अलगाव-सुक्रोज ढाल अंश के द्वारा पदचिह्न परिसरों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है, और उचित साथ साथ गहरी अनुक्रमण के लिए डीएनए पुस्तकालयों की तैयारी गुणवत्ता नियंत्रण vivo अनुवाद में का सही विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है ।
Introduction
mRNA अनुवाद कोशिका में मौलिक प्रक्रियाओं में से एक है, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इसलिए, mRNA अनुवाद कसकर अलग आंतरिक और बाह्य शारीरिक उत्तेजनाओं 1,2के जवाब में नियंत्रित किया जाता है । तथापि, शोधों के विनियमन के तंत्र का अध्ययन करते रहते हैं । यहां, हम ribosome profiling द्वारा उभरते खमीर में अनुवाद के जीनोम चौड़ा ठहराव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । ribosome रूपरेखा तकनीक के समग्र लक्ष्य के लिए अध्ययन और विभिंन सेलुलर शर्तों के तहत विशिष्ट mRNAs के अनुवाद मात्रा है । इस तकनीक का उपयोग करता है अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए मात्रात्मक जीनोम भर में ribosome अधिभोग का विश्लेषण और एकल codon संकल्प 3,4पर vivo में प्रोटीन संश्लेषण की दर की निगरानी की अनुमति देता है । वर्तमान में, इस विधि प्रोटीन अनुवाद के स्तर को मापने का सबसे उंनत साधन प्रदान करता है, और एक उपयोगी खोज जानकारी उपलब्ध कराने के उपकरण है कि अंय वर्तमान में उपलब्ध तकनीकों से नहीं पता चल सकता है साबित हो गया है, जैसे microarrays या अनुवाद राज्य सरणी विश्लेषण (TSAA) 5। के रूप में ribosome प्रतिलिपि स्तर और शोधों के उत्पादन में संयुक्त परिवर्तन पर रिपोर्ट की रूपरेखा, यह भी अंय तरीकों की तुलना में बहुत अधिक संवेदनशीलता प्रदान करता है ।
यह प्रकिया ribosome-सुरक्षित mRNA अंशों 3की गहरी sequencing पर आधारित है । प्रोटीन अनुवाद के दौरान, ribosomes की रक्षा ~ 28 mRNA के nt भाग (पैरों के निशान कहा जाता है) 6। ribosome-संरक्षित टुकड़े के अनुक्रम का निर्धारण करके, राइबो-Seq अनुवादित mRNA पर ribosomes की स्थिति को मैप कर सकते हैं और जो mRNA के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए सक्रिय रूप से प्रोटीन 3,7में अनुवाद होने की संभावना है । इसके अलावा, हम मात्रा के निशान है कि एक दिया mRNA प्रतिलिपि को संरेखित की संख्या की गिनती से mRNA के अनुवाद को मापने कर सकते हैं ।
आदेश में ribosome-संरक्षित टुकड़े को अलग करने के लिए, सेल lysates शुरू में एक अनुवाद अवरोधक के साथ इलाज किया जाता है ribosomes ribonuclease पाचन द्वारा पीछा स्टाल । जबकि मुक्त mRNA और अनुवादित mRNAs के भाग ribosomes द्वारा संरक्षित नहीं ribonuclease द्वारा अपमानित कर रहे हैं, ribosome-संरक्षित mRNA टुकड़े शुद्ध बरकरार ribosome-पदचिह्न परिसरों से बरामद किया जा सकता है । इन mRNA पैरों के निशान तो सीडीएनए पुस्तकालय में बदल रहे हैं और गहरी अनुक्रमण (चित्रा 1) द्वारा विश्लेषण किया. ribosome रूपरेखा के समानांतर में, बरकरार mRNA एक ही नमूना है और अनुक्रम से निकाला जाता है । mRNA बहुतायत माप के साथ राइबो-Seq द्वारा की पहचान अनुवाद के स्तर की तुलना करके, हम विशेष रूप से कर रहे हैं कि जीन की पहचान कर सकते हैं-या नीचे अनुवाद के स्तर पर विनियमित और जीनोम-वाइड स्तर पर mRNA के अनुवाद दक्षता की गणना. हालांकि इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल खमीर के लिए विशिष्ट है, यह भी शोधकर्ताओं जो अंय प्रणालियों में राइबो-Seq प्रोटोकॉल स्थापित करने की कोशिश करेंगे के लिए उपयोगी होना चाहिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
राइबो-Seq दृष्टिकोण विवो में जीनोम-वाइड स्तर 3पर mRNA अनुवाद के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली प्रौद्योगिकी के रूप में उभरा है । इस दृष्टिकोण है, जो एकल codon संकल्प के साथ अनुवाद की निगरानी की अनुमति …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्वास्थ्य अनुदान AG040191 और AG054566 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा VML को समर्थन दिया गया. इस शोध का आयोजन किया गया था जबकि VML एक दूर अनुसंधान उंर बढ़ने के लिए अमेरिकी संघ से अनुसंधान अनुदान प्राप्तकर्ता था ।
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
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