JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Biologie

Fisk Sperm vurdering ved hjælp af Software og afkøling enheder

Published: July 28, 2018
doi:
10.3791/56823
,
1PROiSER R+D S.L., 2Department of Cellular Biology, Functional Biology and Physical Anthropology,University of Valencia

Summary

Denne protokol beskriver en procedure af fisk sperm vurdering ved hjælp af computer-assisteret sædanalyse og afkøling enheder. Softwaren giver en hurtig, nøjagtig og kvantitativ analyse af fisk sædkvalitet baseret på sædcellerne motilitet, som kan være et nyttigt redskab i akvakultur at forbedre reproduktion succes.

Abstract

For evaluering af kvaliteten af gamet er der innovative, hurtig og kvantitative teknikker, der kan give nyttige oplysninger for akvakultur. Edb-systemer til sædanalyse blev udviklet til at måle flere parametre og en af de mest almindeligt målte er sperm motilitet.

Oprindeligt, designet denne computerteknologi til pattedyrarter, selv om det kan også bruges til fisk sædanalyse. Fisk har specifikke egenskaber, der kan påvirke sædcellerne vurdering som en kort motilitet tid efter aktivering og i nogle tilfælde tilpasning til lavere temperaturer. Det er således nødvendigt at ændre både software og hardware komponenter for at effektivisere motilitet analyse for fisk sædanalyse. For pattedyr sperm bruges den varme plade til at opretholde optimale temperaturer på sædcellerne. Men for nogle fiskearter, det er fordelagtigt at bruge en lavere temperatur til at forlænge varigheden af motilitet, da spermen forbliver aktive i mindre end 2 min. Det er derfor nødvendigt at nedkøle prøver ved konstant temperatur over tid af analyse, herunder på optisk mikroskop afkøling enheder. Denne protokol beskriver analysen af fisk sperm motilitet ved hjælp af software til sædanalyse og ny afkøling enheder for at optimere resultaterne.

Introduction

Effekten af reproduktion afhænger af kvaliteten af både mælke-(æg og sædceller)1,–2. Dette er den vigtigste faktor, der bidrager til vellykket befrugtning, giver mulighed for udvikling af levedygtige afkom3,4. Praktisk evaluering af gamet kvalitet er det bedste redskab til at definere frugtbarhed potentiale af et prøveeksemplar.

Blande sperm fra flere hanner er en fælles praksis i produktionen af mange akvatiske kommercielle arter4. Men sperm variabiliteten mellem hanner kan føre til sperm konkurrence, og derfor ikke alle mænd lige så bidrager til genpulje5. I denne forstand er den korrekte vurdering af individuelle ejakulere/sædcellerne funktioner, såsom motilitet, grundlæggende at indhente diskriminerende oplysninger vedrørende individuelle mandlige fertilitet potentielle. Direkte observation af sædkvalitet kan producere upræcise og subjektive data, da det kræver tid og erfaring, hvilket fører til en mangel på konsekvens og uforenelighed af resultater6,7. Men der er mange innovative, hurtig og kvantitative teknikker, der kan give en pålidelig sæd kvalitet analyse2,4.

Computerstøttet sædanalyse blev udviklet for at tilbyde nøjagtige data om sæd kvalitet8. Denne teknologi omfatter udvikling af software forbundet med en fase kontrast mikroskop, der giver mulighed for vurdering af sædkvalitet. Men en begrænsende faktor for motilitet parameter er frame rate af den video kameraet. Enkelte sædcellerne baner er baseret på sædcellerne hoved barycentrum position i på hinanden følgende frames på video-optagelser, som er korreleret med flagellaternes bevægelse mønstre3,9,10, 11. de vigtigste kinetiske parametre måles er lineær hastighed (VSL), krum hastighed (VCL) og gennemsnitlig sti hastighed (VAP). VSL er afstanden mellem start og end-point taget af sædcellerne divideret med tiden. VCL er den reelle hastighed langs den præcise bane truffet sædcellerne. VAP er hastighed langs en afledt glattes sti bane. Disse parametre giver mulighed for yderligere kinetic oplysninger, herunder linearitet (LIN), rethed (STR), wobble (WOB) og slå målinger som amplitude af lateral hoved bevægelse (ALH) og beat-cross frekvens (BCF)4,10.

Sperm analysesystem blev oprindeligt brugt til pattedyrarter, og et af kravene til systemet er at operere ved kropstemperatur af donor (ca. 37 ° C). Denne software kan også bruges til fiskearter; selv om det er nødvendigt at foretage nogle tilpasninger at reducere fejl af sperm analyseresultater. I nogle fiskearter såsom laksefisk og ål8,12, sker befrugtning ved lav temperatur (ca. 4 ° C)2,4. Således, køling enheder bør udvikles for at undgå ubehagelige arbejdsbetingelser. Derudover fisk sædcellerne er immotile i sædvæsken og kræver en osmotisk chok at aktivere motilitet. Ferskvandsfisk har activator medium hypotonic osmolalitet, mens for marine arter medium bør hypertonisk. Men for nogle arter, som laksefisk, ion koncentration kunne også være vigtigt3,4,9. Efter aktivering, er fisk sæd kendetegnet ved en hurtig nedgang af motilitet (mindre end 2 min)13,14 , og høj hastighed, er afgørende for at bestemme den optimale billedhastighed at få pålidelige data15.

Formålet med denne undersøgelse er at designe og anvende køleanlæg for fisk sperm prøver. Derudover definerer denne protokol hvordan til at bestemme de optimale frame rates til etablering af standardprotokoller dyrearten. Anvendelse af denne protokol åbner nye døre i forbindelse med fisk skelsættende evaluering, ved hjælp af den europæiske ål som en model.

Protocol

Procedurer, der involverer dyr emner har været godkendt (2015/VSC/ærter/00064) af den generelle retning af landbrugsproduktionen og husdyr på Universitat Politècnica de Valencia. 1. indsamle sæd fra modne europæiske ål i fangenskab Bemærk: Brug europæiske ål hanner vedligeholdes i tanke med havvand og en recirkulation system ved konstant temperatur (20 ° C). Behandling med hormoner gennem ugentlige intraperitoneal injektion (humant choriongonadotropin (hCG)…

Representative Results

Analyse af tid effekt på sædkvalitet For den europæiske ål, procentdelen af statisk sædcellerne steg fra 15 s til 120 s efter aktivering (fra 24,4% 40,7%), og procentdelen af mobile progressive sædcellerne faldet (fra 36,9% til 20,9%) (Figur 1A og 1B). Baseret på hastighed, sædcellerne celler viste et fald i hastigheden over tid (figur 1…

Discussion

Sperm analyse software, der anvendes i denne protokol er blevet brugt af forskere på verdensplan for forskellige arter, herunder fisk. Fisk har dog nogle specifikke funktioner, der kan påvirke sædcellerne vurdering. Fisk sædcellerne viste høj hastighed i øjeblikket aktivisering hvilke falder hurtigt og fører til en kort tid af motilitet efter aktivering. Desuden temperatur reproduktionshandlinger er arter-afhængige, og i nogle tilfælde kunne være ca. 4 ° C2,…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette projekt har modtaget støtte fra foreningen omkostninger (fødevarer og landbrug COST Action FA1205: AQUAGAMETE, og EUs Horisont 2020 forskning og innovation program under Marie Sklodowska-Curie projekt IMPRESS (GA No 642893). Vi vil gerne takke det videnskabelige team af PROiSER, specielt til studerende Alberto Vendrell Bernabéu, for hans aktive deltagelse i videooptagelsen af dette projekt.

Materials

Human Chorionic Gonadotropin Argent Chemical Laboratories hCG Hormone
Benzocaine Merck E1501 Sigma Anesthesia
sodium bicarbonate Merck S5761 Sigma  P1 medium
sodium chloride Merck 1.06406 EMD Millipore P1 medium
magnesium chloride Merck 1374248 USP P1 medium
potassium chloride Merck P3911-500G P1 medium
calcium chloride Merck C7902-500G P1 medium
commercial salt Aqua Medic  Meersalz Activator solution 
BSA Merck 05470 Sigma Activator solution 
Falcon tubes 15 ml Merck T1943-1000EA
Falcon tubes support Merck R5651-5EA
Eppendorfs Merck T9661-1000EA
Micropipet 20 µl Gilson PIPETMAN® Classic
Micropipet 10 µl Merck Z683787-1EA
Tips for micropipets 20 µl Merck Z740030-1000EA
Tips for micropipets 10 µl Merck Z740028-2000EA
Spermtrack PROiSER Counting chamber
TruMorph PROiSER TruMorph
Microscope UB 200i Serie PROiSER Microscope
Cooler plate PROiSER Prototype
Cooler block PROiSER Prototype
ISAS v1 PROiSER ISAS Software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
  2. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
  3. Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
  4. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
  5. Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
  6. Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
  7. Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
  8. Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
  9. Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
  10. Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
  11. Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
  12. Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout – the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
  13. Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
  14. Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
  15. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis?. Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
  16. Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
  17. Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
  18. Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
  19. Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
  20. Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
  21. Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
  22. Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
  23. Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
  24. Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
  25. Holt, W. V., O’Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
  26. Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
  27. Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
  28. Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
  29. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
  30. Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
  31. Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
  32. Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
  33. Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
  34. Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
  35. David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
  36. Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
  37. Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
  38. Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
  39. Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
  40. Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
  41. Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations’ structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
  42. Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
  43. Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
  44. Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).

Tags

Keywords: Fish SpermSperm QualityCASA TechnologyMotility AnalysisCooling DevicesArtificial FertilizationEuropean EelSperm Sample CollectionSperm DilutionSperm ActivationCooler BlockCASA Software Configuration
check_url/fr/56823?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Caldeira, C., Soler, C. Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices. J. Vis. Exp. (137), e56823, doi:10.3791/56823 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image