Imagerie fonctionnelle des usines de Transcription virale à l’aide de la microscopie en Fluorescence 3D
Summary
Usines de transcriptionnelles virales sont des structures discrètes qui sont enrichis de RNA polymérase cellulaire II pour augmenter la transcription de gènes viraux durant la réactivation. Ici, on décrit une méthode pour localiser les sites de la retranscription activement chromatine virale dans un espace 3D nucléaire par une combinaison de l’hybridation d’immunofluorescence souillant et in situ de RNA.
Abstract
Il est bien connu que la régulation spatiale et temporelle des gènes est partie intégrante de régir l’expression des gènes appropriés. En conséquence, il est précieux pour comprendre où et quand la transcription se déroule au sein de l’espace nucléaire et visualiser la relation entre épisomes infectés au sein du noyau de la cellule même. Ici, les immunofluorescence (IFA) et les poissons-RNA ont été combinedto identifier activement transcrire épisomes herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV). Par coloration antigène nucléaire associé à latence KSHV (LANA), il est possible de localiser où épisomes virales existent dans le noyau. En outre, grâce à la conception des sondes de RNA-FISH pour cibler la région intron d’un gène viral, qui s’exprime uniquement pendant l’infection productive, naissant ARN transcrits peuvent être trouvées. Grâce à cette combinaison de sondes moléculaires, il est possible de visualiser l’Assemblée des usines de grande transcription virale et analyser la réglementation spatiale de l’expression génique virale au cours de la réactivation de KSHV. En incluant la coloration d’anticorps anti-ARN polymérase II, on peut également visualiser l’association entre l’agrégation de l’ARN polymérase II (RNAPII) et la transcription de KSHV durant la réactivation.
Introduction
Il est devenu de plus en plus évident que l’organisation spatio-temporelle du noyau joue un rôle important dans la modulation de l’expression des gènes finement réglé chez les eucaryotes. La plupart des gènes spécifiques des tissus sont réparties sur plusieurs chromosomes et doivent être réglementés de manière synchrone afin de répondre à des stimuli spécifiques dans une manière coordonnée1. Cellules construisent moyeux de chromatine active (ACH) comme un moyen de rassembler des gènes et leurs composants cis-réglementation nucléaires spécifiques de l’espace1.
Il a également été démontré par diverses études que bien que le noyau semble très denses et visqueux, molécules biologiquement actives peuvent traverser le noyau assez rapidement par l’intermédiaire de diffusion2. Conséquemment à cette propriété éphémère, la plupart des protéines liant l’ADN « sautent » du site de liaison à binding site, sentant leur chemin autour de l’espace nucléaire, qui permet pour un noyau hautement adaptatif et polyvalent2.
Malgré ce comportement dynamique des biomolécules dans le noyau nucléaire organes sans membranes tels que (mais non limité à) le nucléole, corps de Cajal et corps nucléaires de leucémie promyélocytaire (PML-n.-b.) existent toujours. C’est par le biais de divers mécanismes tels que des répétitions d’ADN en tandem (nucléole), ARNr (nucléole) et des protéines de structure comme coilin (corps de Cajal) ou PML de protéines (PML-n.-b.) qui détiennent ces constructions ensemble3,,4,5 . Ces structures et autres congrégations comme usines de transcription servent d’échafaudages qui non seulement d’augmenter la concentration locale des composants requis, mais aussi pour la composition des protéines et des acides nucléiques dans eux pour finalement créer un site central pour les fonctions cellulaires efficace6.
Visualisation quand et où les structures nucléaires formulaire fournit une foule de renseignements aux chercheurs qui étudient l’épigénétique. Du point de vue de la virologie, la réactivation du virus infectés de façon latente, comme KSHV, modifie considérablement le paysage du noyau et la distribution des enzymes nucléaires de passer de la transcription principalement de gènes cellulaires à des gènes viraux, en fin de compte à produire des progénitures virales entièrement fonctionnel7,8. Comment KSHV ne manipule pas les mécanismes d’expression de gène cellulaire pour faciliter l’expression des gènes viraux ? Ces informations pourraient également faire la lumière sur les mécanismes de régulation génique cellulaire temporelle.
Comme tous les autres herpèsvirus, KSHV a deux cycles de vie appelés latence et réplication lytique. KSHV réside principalement dans la phase de latence, dans laquelle la plupart de ses gènes viraux expression est réduit au silence, sauf latence associés gènes9,10. Pendant le temps de latence que KSHV produit latence associé à un antigène nucléaire (LANA), qui lie les génomes viraux constitutivement longes chromatine virale avec le chromosome humain11. En raison de la relation intime de LANA avec le génome viral, il est possible d’utiliser les CDI et DAPI pour souiller et de localiser où les épisomes virales sont rapportaient à la chromatine de l’hôte.
Pour étudier la réactivation de KSHV au niveau des épisomes unique et la liaison avec les autres épisomes virales dans une cellule infectée, une stratégie visant à localiser transcribing activement la chromatine virale in situ a été établie. En conséquence, LANA et RNAPII IFA avec intron RNA-poisson ont été combinées, en générant des sondes de RNA-poisson qui se lient à la région de l’intron (sonde exacte on trouvera des séquences du laboratoire Izumiya plus récente publication8) de KSHV K-Rta-la protéine virale clé qui est essentiel et suffisant pour KSHV réactivation-il a été possible d’identifier les cas où la transcription prenait réellement lieu8,11,12,13,14,15 . Cette technique de RNA-poissons d’intron permet aux chercheurs de visualiser où les ARNm est étant transcrite immédiatement avant d’être épissé et exporté vers le cytoplasme16,17.
KSHV peut être réactivée par divers stimuli chimiques, y compris des esters de phorbol comme 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) et inhibiteurs d’histone déacétylase tels que le butyrate de sodium, en outre de KSHV peuvent être induites de réactiver par la surexpression de la le facteur de transcription virale, K-Rta19. Les chercheurs ont augmenté avec succès l’efficacité de la réactivation de KSHV en synchronisant les cycles de la cellule avant induction de réactivation18. Ainsi, pour ces études particulières, les cellules ont été synchronisées à l’aide d’un bloc double thymidine (protocole décrit ci-dessous) et incubé avec TPA et doxycycline (Dox) pendant une courte période. Doxycyline a été utilisé parce que la lignée cellulaire utilisée dans ces expériences a une cassette de K-Rta doxycycline-inductible, qui a été clonée à partir d’ADNc et n’inclut pas la région de l’intron de K-Rta. Bien qu’il soit possible de réactiver à l’aide de KSHV induit seulement l’expression de K-Rta, il a été prouvé par d’autres chercheurs qu’en raison de divers facteurs biochimiques différentes expression K-Rta seule se révèle pour être une réactivation faibles stimuli20. En combinant tout cela et en limitant les incubations de drogue pour un court laps de temps, une réactivation de KSHV robuste mais pas trop artificielle a été réalisée pour l’imagerie.
Après marquage LANA, RNAPII, K-Rta introns et ADN comme décrit dans cet article, imagerie de fluorescence 3D a été réalisée à l’aide de microscope widefield déconvolution. Après le traitement avec le logiciel d’imagerie, la répartition spatiale des épisomes virales actives peut être correctement évaluée. En utilisant cette technique, les questions centrales concernant le caractère fondamental de la formation de nœuds de chromatine active et d’autres structures nucléaires peuvent être étudiées. Avoir des épisomes virales identiques dans une seule cellule qui traite les mêmes éléments réglementaires peut-être représenter un outil de recherche unique pour approfondir la compréhension des mécanismes de régulation génique spatio-temporelle.
Une limitation de plusieurs spécimens de cellule fixés à différents moments afin de caractériser un processus intrinsèquement dynamique moléculaire d’imagerie est que des changements subtils ou à petite échelle dans la distribution de fluorescence sont détectées ou jugées insignifiantes. C’est vrai, sauf dans les rares cas, chaque cellule observée affiche le même changement subtil. Ainsi, la relation complète spatio-temporelle de transcription virale active et autres structures nucléaires ne peut être critique évaluée à l’aide de l’imagerie fixe. Pour relever ces défis techniques, la meilleure approche consiste à des cellules vivantes images qui ont marqué les épisomes virales et de suivre l’emplacement des principaux enzymes cellulaires au fil du temps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a certains aspects du protocole pouvant être modifiés pour tenir compte des circonstances inhabituelles. Le choix de tampons de fixation et permeabilization peut également être modifié. Pour les tampons de fixation, paraformaldéhyde est aussi efficace et l’éthanol peut être utilisé pour la perméabilisation.
Trempe le formaldéhyde avec glycine que PBS est recommandée car elle empêche le formaldéhyde de la désactivation de l’anticorps en absence d’albumine sérique bovi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par une subvention des National Institutes of Health (R01-DE025985) et par un American Cancer Society Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Ce travail a été également soutenu par les subventions accordées par le U.S. Department of Agriculture (2015-67015-23268 et 2014-67015-21787) et une nouvelle subvention d’Initiative de recherche de l’Université de Californie, Davis.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
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