Entwicklung eines In-vitro- Assay, hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Quantitate Zellen (HSPCs) bei der Entwicklung von Zebrafish Embryos
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode um hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen (HSPCs) im embryonalen Zebrafisch quantitate. HSPCs von dissoziierten Zebrafisch sind in Methylcellulose mit unterstützenden Faktoren, Differenzierung in Reife Blut beschichtet. Dies ermöglicht die Erkennung von Blut Mängel und Drogen-screening um leicht durchgeführt werden.
Abstract
Hämatopoese ist ein wesentlicher zellulärer Prozess in dem hämatopoetische Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen (HSPCs) in der Vielzahl der verschiedenen Zell-Linien zu unterscheiden, die Reife Blut umfassen. Isolierung und Identifizierung von dieser HSPCs ist schwierig, weil sie Ex-post-Factodefiniert sind; Sie können nur nach ihrer Differenzierung in bestimmte Zelle Linien definiert werden. In den letzten Jahrzehnten geworden der Zebrabärbling (Danio Rerio) Modellorganismus Hämatopoese zu studieren. Zebrafisch-Embryonen entwickeln ex Uteround von 48 h nach Befruchtung (hpf) haben definitive HSPCs. Assays zur Beurteilung von HSPC Differenzierung generiert und Verbreitung Funktionen wurden entwickelt, unter Verwendung der Transplantation und die anschließende Rekonstitution des blutbildenden Systems neben der Visualisierung von spezialisierten transgener Linien mit der konfokalen Mikroskopie. Allerdings sind diese Tests Kosten unerschwinglich, technisch schwierig und zeitaufwendig für viele Labore. Entwicklung eines in-vitro- Modells HSPCs zu bewerten wäre kostengünstiger, schneller und weniger Schwierigkeiten im Vergleich zu vorher beschriebenen Methoden, so dass Laboratorien zu schnell beurteilen, Mutagenese und Drogen-Bildschirme, die HSPC Biologie betreffen. Dieser neuartige in-vitro- Assay zur HSPCs Bewertung erfolgt durch Beschichtung getrennt ganze Zebrafish Embryos und Hinzufügen von exogenen Faktoren, die nur HSPC Differenzierung und Verbreitung zu fördern. Embryonen sind getrennt in einzelne Zellen und vergoldet mit HSPC-unterstützende Kolonie stimulierende Faktoren, die bewirken, dass sie Kolonie bildende Einheiten (KBE) erzeugen, die aus einer einzigen Stammvater Zelle entstehen. Diese Tests sollen vorsichtigeren Untersuchung der molekularen Wege verantwortlich für HSPC Proliferation, Differenzierung und Verordnung, die Forscher zu verstehen, die Grundlagen der vertebrate Hämatopoese und seine Dysregulation ermöglichen während der Krankheit.
Introduction
Hämatopoese ist der Prozess der Herstellung der Vielzahl von Reife Blutzellen notwendig für das Überleben eines Organismus. Es ist eine wichtige Entwicklungsprozess, die die Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) beinhaltet in einer Vielzahl von entwicklungspolitisch eingeschränkt Zelltypen, die Reife Blut enthalten. Diese HSCs müssen selbst erneuern, so dass das System nie erschöpft ist und sie müssen von der frühen embryonalen Entwicklung bis zum Tod bestehen. Bei Wirbeltieren, ständige Differenzierung und Proliferation von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) genügen, um ausreichend die Mehrheit der Blutzellen wieder aufzufüllen, die Post-mitotische sind und jeden Tag recycelt. HSZ generieren Reife Blutzellen durch die erste Differenzierung in Teilmengen eingeschränkt Vorläuferzellen; gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen (CLP)1, die schließlich T, B- und NK-Zellen produzieren, und gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen (CMPs)2 , die Erythrozyten, Granulozyten, Makrophagen und Megakaryozyten zu generieren. Diese Vorfahren verpflichtet bestimmte Zelle Linien erzeugen und weiter differenzieren in mehr entwicklungsgeschichtlich eingeschränkt Vorläuferzellen wie myeloischen erythroiden Vorläuferzellen (MdEP), die Erythrozyten und Thrombozyten und Granulozyten generieren Makrophagen Stammväter (GVP), die eosinophile, Basophils, neutrophilen Granulozyten und Makrophagen2erzeugen. Identifizieren und isolieren diese Stammväter ermöglicht die Identifikation von wichtigen molekularen Signalwege hämatopoetischen Differenzierung beteiligt und viele hämatopoetische Krankheiten wie Leukämie entstehen, wenn diese Vorläuferzellen nicht richtig zu unterscheiden.
In den letzten Jahrzehnten ist der Zebrafisch (Danio Rerio) Modellsystem wichtige Recherche-Tool für embryonalen und adulten hämatopoetischen Studien geworden. Zebrafisch sind genetische Analyse zugänglicher und die phylogenetisch niedrigsten vertebrate Modell-Arten, die eine ähnliche Gefäßsystem und blutbildenden Systems auf den Menschen haben. Zebrafisch-Embryonen entwickeln ex Utero, und innerhalb von 48 Stunden Post Düngung (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafisch sind auch äußerst fruchtbar, mit Weibchen legen über 100 Eiern in einer einzigen Kupplung, so dass für große Stichproben und experimentelle Replikation. Zebrafisch-Embryonen sind optisch transparent, zulassend mikroskopische Visualisierung des blutbildenden Systems. Mehreren fluoreszierenden transgenen Linien Zebrafisch Kennzeichnung HSCs wie runx1: EGFP Fisch9, cd41: EGFP Fisch10, und Kdrl:mCherry; Cmyb: GFP3 Doppel-positiven Tieren ermöglichen live, in Echtzeit-Visualisierung von HSC Entstehung und Expansion in Vivo3,4,7,8, 9. Der Zebrabärbling schnell Zeit und Entwicklung ex Utero führte zu seiner Verwendung in Mutagenese Studien11,12,13,14,15 und Droge Screening von16,17,18,19,20 für Verbindungen, die therapeutische Versprechung für Erkrankungen des menschlichen Blutes halten. Insgesamt hat Erhaltung des blutbildenden Systems, das Vorhandensein und die einfache Entwicklung von transgenen Linien und schnelle Regenerationszeit der Zebrabärbling ein billig, schnell, flexibel und ideal Modell für hämatopoetische Studien gemacht.
Zahlreiche Methoden der Isolierung und Testen von HSZ wurden in Säugetieren blutbildenden Systeme entwickelt. Ermittler nutzen eine Kombination aus Oberfläche Zellrezeptoren Markus HSCs21,22,23,24, als auch die Fähigkeit der HSCs Efflux Farbstoff25,26zu nutzen. Nachdem diese gekennzeichnet sind, kann Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) ihre räumliche Trennung. Was beweist, dass eine Zelle eine HSC erfordert Bestrahlung ein Wirtstier endogene HSPCs, vermeintliche HSCs Umpflanzen, und beobachten langfristige, Multi-Linie Wiederherstellung aller Blut Zelltypen Reifen zu zerstören. Diese Tests funktionieren gut in Mäusen, da gibt es zahlreiche Zelloberfläche Antikörper gegen hämatopoetischen Zellen und Inzucht Mausstämme, die immun-Abstimmung für die Transplantation erleichtern. Jedoch wurden einige Zebrafisch hämatopoetischen Zelloberfläche Antikörper generierten27, behindern die Identifizierung und Isolierung von HSZ. Die gängigste Methode zum Markieren und Isolieren von Zebrafisch HSCs ist mit transgenen Tieren, wobei ein zellspezifische Promotorsequenz eine fluoreszierende Protein-Expression treibt. Studien haben visualisiert und HSCs in der ventralen Wand der dorsalen Aorta mit Mikroskopie nutzt diese Technik3,4,8,9aufgelistet. Anderen Labors klonaler Stämme von Zebrafisch28,29 generiert haben und im MHC abgestimmt Tiere30erfolgreichen Transplantationen durchgeführt haben. Jedoch diese Techniken sind kostspielig zu vielen Laboratorien sind technisch schwierig und zeitaufwendig sind. Um diese Probleme anzugehen, haben Labors generiert mehrere in-vitro- Tests, um die Präsenz, die Verbreitung Tarife und die Kapazität der Differenzierung der HSPCs31,32,33zu testen, 34,35,36. Diese Tests zeigen, Proliferation und Differenzierung von HSPCs in-vitro-31,32,33,34,35,36, die Rettung von hämatopoetischen Mängel36, und eine effiziente Methode zum entdecken und testen Zytokine33,34,35. Sie wurden auch genutzt, um für HSPC Biologie31,32verantwortlichen Gene zu identifizieren. In dieser Studie nehmen wir diese Tests einen Schritt weiter und erlaubt die Quantifizierung von HSPCs einer sich entwickelnden Zebrafish Embryos. Diese Tests können auch genutzt werden, um die Anzahl der HSPCs im mutierten Tieren quantitate und Tiere mit hämatopoetischen störende Medikamente behandelt. Im Wesentlichen diese Assays sind schnell, vorhanden einige technische Herausforderungen, und kostengünstige Möglichkeiten, um quantitate HSPC zahlen, prüfen ihre Verbreitung und Blöcke in Abgrenzung zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Zebrafisch-Modell-System ist eine effiziente, effektive und kostengünstige Modell für das Studium primitiv und definitive vertebrate Hämatopoese geworden. Generation von Assays, die sind schnell, preiswert, und einigen technische Schwierigkeiten kann zum Testen kleiner Moleküle, mutierte Embryonen zu analysieren und molekulare Signalwege wichtig für HSPC Biologie Aufklärung genutzt werden. In-vitro- Beschichtung der HSPCs von Erwachsenen Zebrafisch ist eine wirksame Methode, Mutagenese, Zytokine und h?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wurde gefördert durch die National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1, D.L.S.), der California State University Program für Bildung und Forschung in der Biotechnologie (CSUPERB: molekulare Kontrolle der Vertebrate hämatopoetischen Nische, D.L.S.) und vom Büro Graduate Studies in California State University Chico (zu A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
