Разработка в Vitro Assay чтобы Quantitate гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в развитии эмбрионов у рыбок данио
Summary
Здесь мы представляем простой метод, чтобы quantitate гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в zebrafish эмбриона. HSPCs от диссоциированных данио рерио в метилцеллюлоза покрыты благоприятных факторов, дифференциации в зрелых кровь. Это позволяет обнаружение крови дефектов и позволяет наркотиков скрининг легко проводить.
Abstract
Кроветворения является важным процессом сотовых в котором гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) дифференцироваться в множество различных клеточных линий, которые составляют пожилые крови. Изоляция и идентификации этих HSPCs трудно, потому что они определены ex post facto в; они могут быть определены только после их дифференцировке в определенной ячейке. За последние несколько десятилетий данио рерио (Danio рерио) стала модель организма для изучения кроветворения. Zebrafish эмбриона развиваются ex внутриутробнои на 48 ч после оплодотворения (hpf) вызвали окончательное HSPCs. анализы для оценки HSPC дифференциации и были разработаны возможности распространения, используя трансплантации и последующих восстановление кроветворной системы в дополнение к визуализации специализированных трансгенных линий с confocal микроскопии. Однако эти анализы являются стоимость непомерно высока, технически сложным и трудоемким для многих лабораторий. Разработка в vitro модели для оценки HSPCs будет экономически эффективным, быстрее, и нынешние трудности меньше, по сравнению с ранее описанные методы, позволяющие лаборатории быстро оценить мутагенеза и наркотиков экраны, которые влияют на HSPC биологии. Этот роман в vitro оценить HSPCs генотипирования отрыве покрытия всей данио рерио эмбрионов и Добавление внешних факторов, которые способствуют только HSPC дифференциации и распространения. Эмбрионы отделить в одной клетки и покрыт HSPC-благоприятной колонии стимулирующие факторы, которые вызывают их для создания колонии формируя единиц (CFUs), которые возникают из клеток одного прародителя. Эти анализы должны позволить более тщательного изучения молекулярные pathways отвечает за распространение HSPC, дифференциация и регулирования, который позволит исследователям понять основы позвоночных кроветворения и его регуляции во время болезни.
Introduction
Кроветворения — это процесс превращения множество зрелых клеток крови, необходимые для выживания организма. Это ключевой процесс развития, который включает дифференциация гемопоэтических стволовых клеток (СКК) в различные типы развивающих ограничены клеток, которые составляют пожилые крови. Эти СКК должны самостоятельно обновлять так, что система никогда не исчерпаны, и они должны сохраняться от раннего эмбрионального развития вплоть до смерти. В позвоночных, постоянное дифференциации и распространения гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) необходимо адекватно пополнить большинство клеток крови, которые после митотическая и перезапуск каждый день. СКК генерировать зрелые клетки крови, первый дифференцироваться в подмножества ограниченного прародитель клеток; Общие лимфоидные предшественники (МЦУЗ)1, который в конечном счете производят T, B и NK клеток и общих миелоидного прародителями (CMPs)2 , генерировать гранулоциты, эритроциты, макрофаги и megakaryocytes. Эти предшественники привержены генерации линий определенных ячеек и далее дифференцироваться в более развивающих ограниченный прародителя клетки как миелоидного эритроидные предшественники (MEP) которые генерируют эритроцитов и тромбоцитов или гранулоцитов прародителями макрофагов (ГИП), которые генерируют2базофилы, эозинофилов, нейтрофилов и макрофагов. Выявление и изоляция этих прародителями позволяет выявлять важные молекулярные пути участвующих в дифференциации кроветворных и многие кроветворных заболеваний, таких как лейкемия возникают, когда эти клетки-предшественники не правильно дифференцировать.
За последние несколько десятилетий данио рерио (Danio рерио) модель системы стала ключевым исследовательского инструмента для исследования гемопоэтических эмбриональных и взрослых. Данио рерио поддаются генетический анализ и филогенетически низкие видов позвоночных модели, которые имеют аналогичные сосудистую и Кроветворная система для людей. Данио рерио эмбрионов развивать ex внутриутробно, и в течение 48 часов пост оплодотворение (hpf) генерировать HSPCs3,4,5,6,,78. Данио рерио являются также весьма плодотворного, с самками, отстаивается 100 яиц в одном сцепления, позволяя для больших выборок и экспериментальной репликации. Данио рерио эмбрионов оптически прозрачным, позволяя микроскопических визуализации кроветворной системы. Несколько флуоресцентные трансгенных линий данио рерио, маркировка СКК например runx1: EGFP рыбы9, cd41: EGFP рыбы10, и kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 двойной инфицированных животных, позволяют жить в реальном времени визуализации HSC возникновение и расширение в естественных условиях3,4,,78, 9. Данио рерио быстрого поколения время и развития бывших utero привела к его использования мутагенеза исследования11,12,13,,1415 и наркотиков Скрининг16,17,18,,1920 для соединений, которые держат терапевтические обещания для расстройств крови человека. В целом сохранению кроветворной системы, присутствие и легко развития трансгенных линий и быстрой регенерации времени сделал данио рерио недорогой, быстрый, гибкий и идеальная модель для гемопоэтических исследований.
Были разработаны многочисленные методы изоляции и тестирования СКК в млекопитающих кроветворной систем. Исследователи могут использовать сочетание поверхности рецепторы клеток марка СКК21,,2223,24, а также использовать способность СКК измеряем краситель25,26. После того, как они помечены, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) позволяет их физическое разделение. Доказав, что ячейка HSC требует облучения хост животных, чтобы уничтожить эндогенного HSPCs, пересадка предполагаемого СКК и наблюдая за долгосрочный, мульти линии растворения всех Зрелые типы клеток крови. Эти анализы хорошо работают в мышей, поскольку есть многочисленные клетк поверхности антител против гемопоэтических клеток и инбредные мыши штаммов, которые облегчают иммунной соответствия для трансплантации. Однако несколько данио рерио гемопоэтических клеток поверхности антитела были созданные27, препятствуя выявление и изоляция СКК. Наиболее распространенный способ пометить и изолировать данио рерио СКК-трансгенных животных, whereby клеток конкретных промоутер последовательность является движущей флуоресцентных белков. Исследования имеют визуализируется и перечислил СКК в брюшной стенке грудной аорты с микроскопией, используя этот метод3,4,8,9. Другие лаборатории породили клоновых штаммов данио рерио28,29 и выполнили успешные трансплантации в MHC-согласованной животных30. Однако эти методы являются стоимость непомерно много лабораторий, технически трудно и много времени. Для решения этих вопросов, лаборатории породили несколько в vitro анализов для проверки присутствия, темпы распространения и возможности дифференциации HSPCs31,,3233, 34,35,36. Эти анализы показывают пролиферации и дифференцировки HSPCs в vitro31,,3233,34,35,36, спасение Кроветворная дефекты36и эффективный метод для обнаружения и тестирования цитокинов33,34,35. Они также были использованы для идентификации генов, ответственных за HSPC биологии31,32. В этом исследовании мы принимаем эти анализы на шаг дальше, позволяя количественный HSPCs развивающихся zebrafish эмбриона. Эти анализы также могут быть использованы чтобы quantitate количество HSPCs в мутанта животных и животных лечат гемопоэтических подрывной препаратами. По сути эти анализы являются быстрый, настоящий несколько технических проблем и недорогих способов quantitate HSPC чисел, изучить их распространения, и расследовать блоков в дифференциации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данио рерио модель системы стала эффективной, действенной и недорогой моделью для изучения примитивных и окончательного позвоночных кроветворения. Поколение анализов, которые являются быстрый, недорогой и представить некоторые технические трудности могут быть использованы для тест…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование было предоставлено национальных институтов здравоохранения (НИЗ: К01-DK087814-01A1 для Д.Ю.Н.), Калифорнийский университет государственной программы для образования и исследования в области биотехнологии (CSUPERB: молекулярные управления позвоночных гемопоэтических ниши для Д.Ю.Н.) и из отделения аспирантуры в Чико Калифорния государственный университет (для A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
