Isolamento do DNA robusto e construção de biblioteca de sequenciamento de alto rendimento para espécimes de herbário
Summary
Este artigo demonstra um protocolo detalhado para isolamento de DNA e construção de biblioteca de sequenciamento da elevado-produção de material de herbário, incluindo resgate de má qualidade excepcionalmente DNA.
Abstract
Herbários são uma fonte inestimável de materiais vegetais que podem ser usados em uma variedade de estudos biológicos. A utilização de espécimes de herbário é associada com um número de desafios, incluindo a qualidade de preservação de amostra, DNA degradado e amostragem destrutiva de espécimes raros. Para utilizar mais eficazmente o material de herbário em projetos de sequenciamento de grande, é necessário um método confiável e escalável de preparação de isolamento e biblioteca de DNA. Este artigo demonstra um protocolo robusto, início-a-ponta para DNA isolamento e elevado-throughput construção da biblioteca de amostras botânicas que não exige modificação para amostras individuais. Este protocolo é adaptado para planta baixa qualidade secada material e leva vantagem de métodos existentes através da otimização de moagem de tecido, modificando a seleção de tamanho de biblioteca e introduzindo um passo opcional reamplification para bibliotecas de baixo rendimento. Reamplification de bibliotecas de DNA de baixo rendimento pode salvar amostras provenientes de espécimes de herbário potencialmente valioso e insubstituível, eliminando a necessidade de amostragem destrutiva adicional e sem a introdução de viés de sequenciamento discernível para comum aplicações filogenéticas. O protocolo foi testado em centenas de espécies de gramíneas, mas é esperado para ser adaptável para o uso em outras linhagens de planta após verificação. Este protocolo pode ser limitado por DNA extremamente degradado, onde não existem fragmentos na faixa de tamanho desejado, e por metabólitos secundários presentes em alguns materiais vegetais que inibem limpo isolamento do DNA. Em geral, este protocolo introduz um método rápido e abrangente que permite o isolamento de DNA e preparação da biblioteca de 24 amostras em menos de 13 h, com apenas 8 h de tempo ativo de hands-on com modificações mínimas.
Introduction
Coleções de herbário são uma fonte potencialmente valiosa de espécies e diversidade genômica para estudos incluindo filogenética1,2,3, genética de populações4,5, conservação Biologia6, espécies invasoras biologia7e de evolução do traço8. A capacidade de obter uma rica diversidade de espécies, populações, localizações geográficas e pontos de tempo destaca o “tesouro”9 que é o herbário. Historicamente, a natureza degradada do herbário-derivada de ADN tem prejudicado projetos baseados em PCR, muitas vezes relegando pesquisadores usando apenas marcadores encontrados em cópia elevada, tais como regiões do genoma do cloroplasto ou do espaçador transcrito interno (ITS) do ribossômico RNA. Qualidade dos espécimes e DNA variam amplamente baseado em métodos de preservação9,10, com quebras de dupla-hélice e fragmentação do calor usado no processo de secagem, sendo as formas mais comuns de danos, criando o so-called 90% DNA de lock-up que tem hipotecada estudos baseados em PCR11. Além de fragmentação, a questão segundo mais prevalente no herbário genómica é contaminação, tais como que derivado de fungos endofíticos13 ou fungos adquiriram após a morte, após a colheita, mas antes de montar no herbário12, embora Este problema pode ser resolvido bioinformatically dado do banco de dados bem fúngico (veja abaixo). Um terceiro e menos comum, o problema é a modificação de sequência a citosina desaminação (C/G→T/A)14, embora estima estar baixa (~ 0,03%) em espécimes de herbário11. Com o advento do sequenciamento de alto rendimento (HTS), a questão da fragmentação pode ser superada com leituras curtas e sequenciamento profundidade12,15, permitindo a aquisição de dados de nível de genômica de numerosos espécimes com baixa qualidade DNA e por vezes mesmo permitindo de sequenciamento do genoma inteiro15.
Amostras de herbário são cada vez mais frequentemente utilizadas e são um componente maior de projetos filogenética16. Um desafio atual da utilização de espécimes de herbário para HTS é consistentemente a obtenção suficiente DNA encalhado dobro, uma condição prévia necessária para protocolos de sequenciamento, de inúmeras espécies em tempo hábil, sem a necessidade de otimizar métodos para indivíduo espécimes. Neste trabalho, um protocolo para extração de DNA e preparação da biblioteca de espécimes de herbário é demonstrado que tira proveito dos métodos existentes e modifica-los para permitir resultados rápidos e replicáveis. Este método permite a completo de processamento de amostra para uma biblioteca de 24 amostras em 13 h, com tempo de hands-on de 8 h, ou 16 h, com tempo de hands-on 9 h, quando a etapa opcional reamplification é necessária. Processamento simultâneo de mais amostras é viável, embora o fator limitante é centrífuga capacidade e habilidade técnica. O protocolo é projetado para exigir apenas típico equipamento de laboratório (thermocycler, centrífuga e suportes magnéticos) em vez de equipamentos especializados, tais como um nebulizador ou sonicador, para a tosquia de DNA.
Qualidade de DNA, tamanho do fragmento e a quantidade estão limitando fatores para a utilização de espécimes de herbário em experimentos de sequenciamento de alto rendimento. Outros métodos para isolar o DNA de herbário e criar bibliotecas de sequenciamento de alta produtividade têm demonstrado a utilidade de usar tão pouco quanto 10 ng de DNA16; no entanto eles exigem experimentalmente determinando o número ideal de PCR ciclos necessários para a preparação de biblioteca. Isso se torna impraticável quando lidar com quantidades extremamente pequenas de duplo viável encalhado DNA (dsDNA), como alguns espécimes de herbário produzem DNA apenas suficiente para uma preparação única biblioteca. O método aqui apresentado usa um único número de ciclos, independentemente da qualidade da amostra, para que nenhum DNA é perdido em passos de otimização de biblioteca. Em vez disso, um passo de reamplification é invocado quando bibliotecas não respeitem os valores mínimos necessários para sequenciamento. Muitas amostras de herbário são raras e possuem pouco material, tornando-se difícil justificar a amostragem destrutiva em muitos casos. Para combater isso, o protocolo apresentado permite dsDNA entrada tamanhos menos de 1.25 ng para o processo de preparação de biblioteca, ampliando o escopo das amostras viáveis para alta produtividade de sequenciamento e minimizando a necessidade de amostragem destrutiva de espécimes.
O protocolo seguinte foi otimizado para gramíneas e testado em centenas de espécies diferentes de amostras de herbário, embora esperamos que o protocolo pode ser aplicado a muitos outros grupos de plantas. Ele inclui uma etapa de recuperação opcional que pode ser usada para salvar a baixa qualidade e/ou espécimes raros. Este protocolo baseado em mais de 200 espécimes de herbário testados, funciona em espécimes com tecido baixa entrada e qualidade, permitindo a preservação de espécimes raros através de amostragem destrutiva mínima. Aqui é mostrado que este protocolo pode fornecer bibliotecas de alta qualidade que podem ser sequenciadas para projetos baseados em phylogenomics.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui apresentado é um método abrangente e robusto para isolamento de DNA e sequenciamento de preparação da biblioteca de amostras de planta seca. A consistência do método e necessidade mínima de alterá-lo baseado em amostra qualidade fazer escalável para projetos de sequenciamento de grande baseada no herbário. A inclusão de uma etapa opcional reamplification para baixo rendimento bibliotecas permite a inclusão de baixa qualidade, baixa quantidade, rara ou historicamente importantes amostras que n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Taylor AuBuchon-Elder, Jordan Teisher e Kristina Zudock para assistência em espécimes de herbário de amostragem e o jardim botânico de Missouri para o acesso aos espécimes de herbário para amostragem destrutiva. Este trabalho foi apoio por um subsídio da Fundação Nacional de ciência (DEB-1457748).
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
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