Anriking av bakteriell lipoproteiner og utarbeidelse av N-terminal Lipopeptides for strukturelle fastsettelse av massespektrometri
Summary
Anriking av bakteriell lipoproteiner bruker en ikke-ioniske surfactant fase partisjonering metoden er beskrevet for direkte bruk i TLR analyser og andre programmer. Videre skritt er detaljert forberede N-terminal tryptic lipopeptides strukturelle karakterisering av massespektrometri.
Abstract
Lipoproteiner er viktige bestanddeler av bakteriell celle konvolutten og potent aktivator av pattedyr medfødte immunforsvaret. Til tross for betydningen av både celle fysiologi og immunologi gjenstår mye å bli oppdaget om romanen lipoprotein skjemaer, hvordan de er synthesized og effekten av ulike former på verten immunitet. For å aktivere grundige studier på lipoproteiner, denne protokollen beskriver en metode for bakteriell lipoprotein berikelse og utarbeidelse av N-terminal tryptic lipopeptides for strukturelle fastsettelse av matrix-assistert laser desorption ionization-tiden for flygningen massespektrometri (MALDI-TOF MS). Utvide på en etablert Triton X-114 fase partisjonering for lipoprotein utvinning og berikelse fra bakteriell cellemembranen, protokollen inneholder flere trinn for å fjerne ikke-lipoprotein forurensninger, øke lipoprotein avkastning og renhet. Siden lipoproteiner er vanlige i Toll-like reseptor (TLR) analyser, er det viktig å først karakterisere N-terminal strukturen av MALDI-TOF MS. Herein, en metode er presentert for å isolere konsentrert hydrofobe peptider anriket på N-terminal lipopeptides egnet for direkte analyse av MALDI-TOF MS/MS. lipoproteiner som har blitt atskilt av natrium Dodecyl Sulfate Poly-akrylamid Gel geleelektroforese (SDS-side) overføres til en nitrocellulose membran, fordøyd i situ med Trypsin, vasket sekvensielt for å fjerne polar tryptic peptider og endelig elut med kloroform-metanol. Når kombinert med MS av mer polar trypsinized peptider fra vask løsninger, gir denne metoden både identifisere lipoprotein og karakteriserer sin N-terminus i et enkelt eksperiment. Forsettlig natrium adduct formasjon kan også brukes som et verktøy for å fremme mer strukturelt informativ fragmentering spectra. Til slutt, anriking av lipoproteiner og fastsetting av deres N-terminal strukturer vil tillate mer omfattende studier på denne allestedsnærværende klassen av bakteriell proteiner.
Introduction
Bakteriell lipoproteiner er preget av en bevart N-terminal lipid-endret cystein som forankrer globular protein domenet cellemembranen overflaten. De er universelt fordelt i bakterier, utgjør 2 til 5% av alle cellulære gener i en typisk genomet1. Lipoproteiner spille viktige roller i en rekke cellulære prosesser, inkludert nærings-opptak, signaltransduksjon, montering av protein komplekser, og opprettholde celle konvolutt konstruksjonssikkerhet2. I patogene bakterier tjene lipoproteiner som virulens faktorer3,4. Under en infeksjon oppfordrer anerkjennelse av N-terminal lipopeptides av Toll-like reseptor (TLR) 2 en medfødte immunforsvaret fjerne invaderende patogener. Avhengig av N-terminal acylation staten, er lipoproteiner generelt anerkjent av alternative TLR2 heterodimeric komplekser. TLR2-TLR1 gjenkjenner N-acylated lipopeptides, mens TLR2-TLR6 binder gratis lipopeptide α-amino termini. Når bundet, konvergere signalveier for å indusere utskillelsen av proinflammatory cytokiner3,4.
Tidligere var det antatt at lipoproteiner fra Gram-positive bakteriene var diacylated og de fra Gram-negative bakterier var triacylated, ulike i fravær eller tilstedeværelse av en amid knyttet fettsyrer på bevarte N-terminal cystein rester. Denne antagelsen ble støttet av mangel på sekvens orthologs i Gram-positive genomer til Lnt, Gram-negative N-acyl-transferase som danner triacylated lipoproteiner5. Men har studier nylig avdekket lipoprotein triacylation i Gram-positive Firmicutes at mangel lnt, samt tre nye N-terminal lipoprotein strukturer, kalte den peptidyl, lyso og N –acetylen skjemaer6,7 ,8. Disse funnene heve spørsmål om mulig ennå-å-være-oppdaget lipoprotein former, sammen med grunnleggende spørsmål om hvordan disse romanen lipoproteiner er gjort og hva fysiologiske formål eller fordel ulike former formidle. Videre vise de tydelig gjeldende russernes genomics å forutsi lipoprotein struktur. Faktisk identifisert vi nylig en roman klasse av lipoprotein N-acyl transferases, kalt Lit, Enterococcus faecalis og Bacillus cereus som gjør lyso-form lipoproteiner9. Dette angir behovet for å kontrollere eksperimentelt lipoprotein struktur, som kan være utfordrende deres ekstremt hydrofobe natur og begrenset metoder tilgjengelig som karakteriserer sin molekylære struktur.
For å lette studier på lipoprotein induksjon av immunrespons i verten, samt N-terminal strukturelle besluttsomhet, har vi tilpasset flere beskrevet tidligere protokoller for å rense bakteriell lipoproteiner og forberede N-terminal tryptic lipopeptides for analyse av MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteiner er beriket med en etablert Triton X-114 (heretter referert til som surfactant eller TX-114) fase partisjonering metoden, med optimalisering fjerne forurensende ikke-lipoproteiner og øke lipoprotein utbytte. Disse lipoproteiner er egnet for direkte bruk i TLR analyser eller ytterligere rensing av SDS-side. MALDI-TOF MS, overføring av lipoproteiner til nitrocellulose membran gir et stillas for effektiv i situ trypsin fordøyelsen, vasking og påfølgende elueringsrør fra membranen overflaten, noe som resulterer i svært renset N-terminal lipopeptides. Nitrocellulose har vist seg å lette eksempel håndtering og forbedre sekvens dekning for svært hydrofobe peptider fra integrert membran proteiner13,14, samt lipoproteiner9,10 . Metoden har fordelen av fractionating peptider basert på polaritet, slik at mellomliggende vask løsninger kan bli analysert for høy visshet protein identifikasjon med N-terminal strukturelle bestemmelse i et enkelt eksperiment . Denne protokollen unikt funksjoner tilsiktet natrium adduct formasjon å fremme overordnede ion fragmentering mot dehydroalanyl ioner under MS-/ MS, hjelpe strukturelle tildeling av N– acylation. N-terminus ligger begge mest variabel og viktige funksjonen gjelder TLR anerkjennelse av lipoproteiner. Samlet har denne protokollen tillatt intensiv og reproduserbar studier på lipoproteiner, med de individuelle etappene rensing og strukturelle vilje av MALDI-TOF MS lett tilpasses avhengig av det overordnede målet med forsøket.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen her beskriver to forskjellige stadier av lipoprotein karakterisering: berikelse av TX-114 fase partisjonering og strukturelle fastsettelse av MALDI-TOF MS. Under TX-114 utvinning fjerner ekstra sentrifugering skadelige proteiner som bunnfall under denne prosessen, etterfulgt av aceton nedbør å gi høyanriket lipoproteiner. Begrenser omfanget av hvert preparat til 15-mL verdi av celler, kan flere prøver lett behandles parallelt, og eventuelt samlet på slutten av protokollen.
For…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Meredith lab ble støttet av oppstart midler gitt av Eberly College of Science (Pennsylvania State University). Vi takker Dr. Tatiana Laremore for tekniske råd og tilgang til utstyr ved Penn State Proteomikk og masse massespektrometri Core anlegget, University Park, PA, hvor masse spectrometric analyser ble utført.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS – a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
