Guidet protokoll for Fecal mikrobiell karakterisering av 16S rRNA-Amplicon sekvenser
Summary
Dette manuskriptet beskriver detaljert standardisert protokollen høy gjennomstrømming 16S rRNA-amplicon sekvenser. Protokollen introduserer en integrert, uniformerte, mulig og rimelig-protokoll fra fecal eksemplar samlingen gjennom data analyser. Denne protokollen aktiverer analyse av store antall prøver med strenge standarder og flere kontroller.
Abstract
Den menneskelige tarmen microbiome spiller en sentral rolle i å beskytte celler fra skade, energi og næringsstoffer og fremme immunitet. Avvik fra det som regnes som en sunn bakterieflora komposisjon (dysbiosis) kan forringe vitale funksjoner fører til patologisk forhold. De senere og pågående forskningen har vært rettet mot karakterisering av assosiasjoner mellom mikrobiell komposisjon og helse og sykdom.
Fremskritt i høy gjennomstrømming sekvensering teknologi aktiverer karakteristikk av tarmen mikrobiell sammensetningen. Disse metodene omfatter 16S rRNA-amplicon sekvensering og hagle sekvensering. 16S rRNA-amplicon sekvensering brukes til profil taxonomical komposisjon, mens hagle sekvensering inneholder tilleggsinformasjon om genet spådommer og funksjonelle merknader. En fordel i bruke en målrettet sekvensering 16S rRNA genet variable regionen er vesentlig lavere kostnadene sammenlignet med hagle sekvensering. Sekvensen forskjeller i 16S rRNA genet brukes som et mikrobiell fingeravtrykk til å identifisere og telle ulike taxa i en enkelt prøve.
Store internasjonale arbeidet har engasjert standarder for 16S rRNA-amplicon sekvenser. Imidlertid rapporterer flere studier en vanlig kilde av variasjonen skyldes satsvise effekt. For å redusere denne effekten, uniformerte protokoller for eksempel innsamling, må behandling og sekvensering implementeres. Denne protokollen foreslår integrering av bredt brukt protokoller fra fecal eksemplar innsamling til data analyser. Denne protokollen inneholder en kolonne-fri, direkte PCR-tilnærming som gjør at samtidige håndtering og DNA utvinning av store antall fecal eksempler sammen med PCR forsterkning av regionen V4. I tillegg protokollen beskriver rørledningen analyse og gir et skript med den nyeste versjonen av QIIME (QIIME 2 versjon 2017.7.0 og DADA2). Denne trinnvise protokollen er rettet til å veilede dem som er interessert i å initiere bruken av 16S rRNA-amplicon sekvenser i en robust, reproduktive, brukervennlig, detaljert måte.
Introduction
Konsentrert innsats har blitt gjort for bedre å forstå microbiome mangfold og overflod, som en del av fange forskjellen og likhetene mellom individer i sunn og patologiske forhold. Age2,3, geografi4, livsstil5,6og sykdom5 ble vist å være knyttet til sammensetningen av tarmen microbiome, men mange betingelser og populasjoner har ennå ikke fullt preget. Nylig har det blitt rapportert at microbiome kan endres i terapeutiske programmer7,8,9. Derfor er ekstra innsikt i forholdet mellom ulike fysiologiske forhold og mikrobiell sammensetningen første skritt mot optimalisering av potensielle modifikasjoner.
Tradisjonelle mikrobiell kultur metoder er begrenset av lav avkastning10,11, og er definert som en binær stat der en bakterier er tilstede i tarmen eller ikke. Høy gjennomstrømming DNA-baserte sekvensering har revolusjonert microbial ecology, slik at erobringen av alle medlemmer av mikrobielle samfunnet. Imidlertid lese sekvens lengde og kvalitet er fortsatt utfordringer til nøyaktig taksonomi tildeling12. Videre kan høy gjennomstrømming basert eksperimenter lide av satsvise effekter, der målinger påvirkes ikke-biologiske eller ikke-vitenskapelige variabler13. De siste årene, er flere programmer etablert for å studere den menneskelige microbiome, inkludert amerikanske Gut prosjektet, USA (US) Human Microbiome Project og Storbritannia (UK) MetaHIT prosjektet. Disse initiativene har generert store mengder data som ikke er lett sammenlignbare skyldes manglende samsvar i deres tilnærminger. En rekke internasjonale prosjekter som International Human Microbiome konsortiet, International Human Microbiome standarder prosjektet, og National Institute of Standards and Technology (NIST) forsøkte å løse noen av disse problemene14 , og utviklet standarder for microbiome målinger som bør aktivere oppnåelse av pålitelige reproduktive resultater. Beskrevet her er en integrert protokoll flere bredt brukte metodene15,16 for 16S rRNA høy gjennomstrømming sekvensering (16S-seq) starter fra fecal eksemplar samlingen gjennom data analyser. Protokollen beskriver en kolonne uten PCR tilnærming, opprinnelig designet for direkte ekstraksjon av DNA16, for å aktivere samtidig håndtering av store mengder fecal eksempler på relativt kort tid med høy kvalitet forsterket DNA for mål sekvensering av mikrobielle variable V4 regionen på en felles sekvensering plattform. Denne protokollen som mål å lede forskere interessert i å initiere bruken av 16S rRNA-amplicon sekvenser i en robust, reproduktive, brukervennlig, detaljert måte, viktige kontroller. Har en guidet og detaljert steg-for-trinn protokollen kan minimere satsvise effekt og dermed tillater mer sammenlignbart sekvensering resultater mellom laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA-amplicon og metagenomics hagle sekvensering har vunnet popularitet i klinisk mikrobiologi programmer21,22,23. Disse teknikkene er fordelaktig i økt å fange culturable og ikke-culturable taxa, gir data om den relative overfloden av sykdomsfremkallende inoculum og deres evne til å identifisere mer presist en polymicrobial smittsomme fingeravtrykk24. Fremskritt innen microbiome forskning har generert store mengder data som ikke er…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet var støttes delvis av programmet-CORE (gir nei 41/11), Israel Science Foundation (grant nr 908/15) og europeiske Crohns og kolitt organisasjon (ECCO).
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
References
- Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
- De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
- Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
- Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
- Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
- Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
- Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
- Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
- Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
- Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
- Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
- Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
- Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
- Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
- Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).
