Protocollo guidata per caratterizzazione microbica fecale mediante sequenziamento del 16S rRNA-amplicone
Summary
Questo manoscritto descrive un dettagliato protocollo standardizzato di alta-16S rRNA-amplicone sequenziamento. Il protocollo introduce un protocollo integrato, in uniforme, fattibile ed economico a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l’analisi dei dati. Questo protocollo consente l’analisi di un gran numero di campioni con rigorosi standard e diversi controlli.
Abstract
Il microbioma intestinale umano svolge un ruolo centrale nella protezione delle cellule dall’infortunio, nella trasformazione di energia e nutrienti e nel promuovere l’immunità. Deviazioni da quello che è considerato una composizione del microbiota sano (disbiosi) possono compromettere le funzioni vitali, portando a condizioni patologiche. Gli sforzi recenti e continue ricerche che sono state rivolte verso la caratterizzazione delle associazioni fra composizione microbica e la salute umana e la malattia.
Advances in tecnologie di sequenziamento ad alta velocità consente la caratterizzazione della composizione microbica dell’intestino. Questi metodi includono sequenziamento del 16S rRNA-amplicone e sequenziamento shotgun. Sequenziamento del 16S rRNA-amplicon viene utilizzata per analizzare la composizione tassonomica, mentre sequenziamento shotgun fornisce ulteriori informazioni su previsioni di gene e annotazione funzionale. Un vantaggio nell’utilizzo di un metodo di sequenziamento mirato della regione variabile del 16S rRNA gene è il suo costo notevolmente inferiore rispetto al sequenziamento shotgun. Differenze di sequenza nel gene del rRNA 16S vengono utilizzate come un’impronta digitale microbica per identificare e quantificare i diversi taxa all’interno di un singolo campione.
Principali iniziative internazionali hanno arruolato standard per sequenziamento del 16S rRNA-amplicon. Tuttavia, parecchi studi segnalano una fonte comune di variazione causato dall’effetto di batch. Per minimizzare questo effetto, in uniforme protocolli per la raccolta del campione, l’elaborazione e l’ordinamento deve essere implementato. Questo protocollo propone l’integrazione dei protocolli ampiamente utilizzati a partire dalla raccolta dei campioni fecali per analisi dei dati. Questo protocollo include un approccio diretto-PCR privo di colonna, che consente la gestione simultanea ed estrazione di DNA di un gran numero di campioni di feci, insieme con l’amplificazione di PCR della regione V4. Inoltre, il protocollo descrive la pipeline di analisi e fornisce uno script utilizzando l’ultima versione di QIIME (QIIME 2 versione 2017.7.0 e DADA2). Questo protocollo passo dopo passo si rivolge a chi è interessato a iniziare l’uso del sequenziamento del 16S rRNA-amplicone in modo robusto, riproduttivo, facile da usare e dettagliato guida.
Introduction
Sono concentrato sforzi per comprendere meglio microbiome diversità e abbondanza, come un altro aspetto di catturare la differenza e le somiglianze tra individui in condizioni sane e patologiche. Età2,3, Geografia4, lifestyle5,6e malattia5 sono stati indicati per essere associati con la composizione del microbioma intestinale, ma molte condizioni e popolazioni non sono ancora state completamente caratterizzata. Recentemente è stato segnalato che il microbioma può essere modificato per applicazioni terapeutiche7,8,9. Di conseguenza, ulteriori approfondimenti sul rapporto tra varie condizioni fisiologiche e la composizione microbica sono il primo passo verso l’ottimizzazione di potenziali future modifiche.
I metodi tradizionali di coltura microbica sono limitati da basse rese10,11e sono concettualizzati come uno stato binario dove è un batterio presente nell’intestino o non. Alto-rendimento di sequenziamento del DNA ha rivoluzionato l’ecologia microbica, consentendo la cattura di tutti i membri della comunità microbica. Tuttavia, la sequenza legge lunghezza e qualità rimangono significativi ostacoli alla tassonomia accurata assegnazione12. Inoltre, esperimenti di basati ad alta velocità possono soffrire di effetti di batch, dove misure sono influenzate da variabili non biologico o non-scientifica13. Negli ultimi anni, diversi programmi sono stati istituiti per studiare il microbioma umano, compreso il progetto americano Gut, il progetto microbioma umano di Stati Uniti (US) e il progetto MetaHIT Regno Unito (UK). Queste iniziative hanno generato grandi quantità di dati che non sono facilmente paragonabili a causa di una mancanza di coerenza nei loro approcci. Una varietà di progetti internazionali come International Human Microbiome Consortium, il progetto di International Human Microbiome standard e il National Institute of Standards e tecnologia (NIST) ha tentato di risolvere alcuni di questi problemi14 e sviluppato standard per misure di microbiome che dovrebbero consentire il raggiungimento di risultati riproduttivi affidabile. È descritto qui un protocollo integrato di diversi metodi ampiamente usati15,16 per 16S rRNA high throughput sequenziamento (16S-seq) a partire dalla raccolta del campione fecale attraverso l’analisi dei dati. Il protocollo descrive un approccio privo di colonna PCR, originariamente progettato per estrazione diretta della pianta del DNA16, per abilitare la gestione simultanea di un numero elevato di fecale campioni in un tempo relativamente breve di alta qualità ha amplificato il DNA per mirati sequenziamento della regione V4 variabile microbica su una comune piattaforma di sequenziamento. Questo protocollo mira a guidare gli scienziati interessati a iniziare l’uso del sequenziamento del 16S rRNA-amplicone in modo robusto, riproduttivo, facile da usare, dettagliato, utilizzando controlli importanti. Avendo un protocollo guidate e dettagliate passo a passo può minimizzare l’effetto di batch e così vi permetterà risultati di sequenziamento più comparabili tra i laboratori.
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA-amplicone e sequenziamento shotgun metagenomica hanno guadagnato popolarità in microbiologia clinica applicazioni21,22,23. Queste tecniche sono vantaggiose in loro una maggiore capacità di catturare taxa coltivabili e non coltivabili, fornendo dati relativi l’abbondanza relativa dell’inoculo di patogeno e la loro capacità di identificare più precisamente un polimicrobica infettiva 24di impronte digitali. I progressi nel campo …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte dal programma-CORE (concede n. 41/11), la Israel Science Foundation (concessione n. 908/15) e l’europeo di Crohn e colite organizzazione (ECCO).
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
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