Le protocole ici décrit les interactions de protéine purifiée hEAG1 de canal ionique avec la petite molécule lipidique ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). La mesure démontre que BLI pourrait être une méthode potentielle pour le dépistage de nouvelles petites molécules ion canal ligand.
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Article de méthode
Capturer la cinétique de l’Interaction d’une protéine canal ionique avec petites molécules par le dosage de l’interférométrie Bio-couche
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’essai de l’interférométrie (BLI) bio-couche est un outil précieux pour la mesure des protéines et des interactions entre protéines à petites molécules. Nous décrivons ici tout d’abord l’application de cette nouvelle technique exempte d’étiquette pour étudier l’interaction des humains EAG1 protéines de canal (hEAG1) avec la petite molécule PIP2. canal de hEAG1 a été reconnu comme cible thérapeutique potentielle en raison de son aberrante surexpression dans les cancers et des mutations de gain de fonction un peu impliqués dans certains types de maladies neurologiques. Nous avons purifié hEAG1 protéines de canal d’un système d’expression stable chez les mammifères et mesuré l’interaction avec PIP2 par BLI. La mesure efficace de la cinétique de la liaison entre la protéine hEAG1 et PIP2 montre que le dosage BLI est une approche de haut débit potentielle utilisée pour le dépistage de nouvelles petites molécules ligand en pharmacologie des canaux ioniques.
Introduction
Ciblant les protéines de canal cellulaire ion surface accessible avec petites molécules offre un énorme potentiel pour le dépistage de ligand et découverte de médicaments biologiques1,2,3. Ainsi, un outil approprié est nécessaire pour l’étude de l’interaction entre les canaux ioniques et de petites molécules et de leur fonction correspondante. L’enregistrement de patch-clamp a été démontrée pour être une technique unique et irremplaçable dans test fonctionnel de canal ionique. Toutefois, déterminer si les petites molécules ciblent directement les canaux ioniques nécessitent d....
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Protocole
Remarque : La lignée de cellules HEK-293 t exprimant continuellement FLAG-le tag hEAG1 protéine du canal est construite par transfectants un plasmide LENTIVIRAUX pCDH contenant la séquence d’ADN de hEAG1 avec un drapeau à l’extrémité C-terminale distale dans les cellules HEK-293 t suivie par la résistant à la puromycine sélection décrite précédemment15.
1. affinity Purification de drapeau-le tag hEAG1 canal protéique des cellules HEK-293 t
- Décongelez les cellules exprimant de manière stable des chaînes de hEAG1 de l’azote liquide dans l’eau chaude (37 ° C) rapidement. Les cellules (environ 5 x 106
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Résultats
Nous avons purifié la protéine de canal de hEAG1 de fusion drapeau de hEAG1 stablement surexprimée de cellules HEK-293 t. La fonction de cette protéine de fusion a été démontrée en utilisant la méthode de patch clamp et la qualité et la spécificité de la protéine purifiée sont confirmées par Western blot (Figure 1). La protéine purifiée de canal est biotinylé pour effectuer une analyse de l’interaction avec les lipides (PIP2) à l’aide de l’analyse .......
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Discussion
Canaux ioniques membranaires ont été vérifiées comme les principales cibles thérapeutiques de plus de 13 % des médicaments connus pour le traitement d’une variété de maladies humaines, y compris les troubles cardiovasculaires et neurologiques,18. Patch-clamp de l’enregistrement, la méthode de référence pour mesurer le fonctionnement des canaux ioniques à petites molécules, a été utilisée pour les ligands de canal d’ion de dépistage. Cependant, ces approches électrophysiologiques ne peuvent démontr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par Bio-ID Center et SJTU fonds interdisciplinaire de recherche en médecine et ingénierie (YG2016QN66), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31271217) et National base Research Programme of China (2014CB910304).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Sérum fœtal bovin | Gibco | 10270 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Gibco | 1697550 | |
| Boîte de culture cellulaire | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitut | Amresco | E109 | |
| Chlorure de sodium | BBI Sciences de la vie | A610476 | |
| Chlorure de potassium | BBI Sciences de la vie | A610440 | |
| Albumine sérique bovine | BBI Sciences de la vie | A600332 | |
| Polyoxyéthylène-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Sciences de la vie | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/Forté ; Bio | 30-5048 | |
| Logiciel d’acquisition de données | Pall/Forté ; Bio | Version 7.1 | |
| Logiciel d’analyse de données | Pall/Forté ; Bio | Version 7.1 | |
| Biocapteur/Streptavidine | Pall/Forté ; Bio | 18-5019 | |
| Plaque de microtitration | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotine | ThermoFisher | 21338 | |
| Machine centrifuge | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Échelle de protéines précolorées | ThermoScientific | 318120 | |
| Appareil d’ultrafiltration | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL de 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Anticorps monoclonal ANTI-FLAG M2 | Sigma | F1804 | Dilution 1:2000 |
| chèvre Anticorps secondaire conjugué HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | Dilution 1:5000 |
| Kit de dosage amélioré des protéines BCA | Beyotime | P0010 | |
| Inhibiteur de protéase Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Système d’imagerie | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Système de transfert Western | BIO-RAD |
Références
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K.
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Réimpressions et autorisations
