Absolut kvantifiering av mikroRNA plasmanivåer hos Cynomolgus-apor använder kvantitativ realtids omvänd Transkription PCR
Summary
Denna rapport beskriver ett protokoll för mätning av de absoluta nivåerna i plasma miRNA, använder kvantitativ realtids omvänd Transkription PCR med eller utan före förstärkning. Detta protokoll ger bättre förståelse av mängden plasma MicroRNA och tillåter kvalitativ bedömning av motsvarande data från olika studier eller laboratorier.
Abstract
RT-qPCR är en av de vanligaste metoderna för att bedöma enskilda mål microRNA. MicroRNA mäts vanligtvis i förhållande till ett referensprov. Detta tillvägagångssätt är lämpligt för att undersöka fysiologiska förändringar i genen uttryck målnivåer. Men är absolut kvantifiering med bättre statistisk analys att föredra för en övergripande bedömning av gen uttryck nivåer. Absolut kvantifiering är fortfarande inte i allmänt bruk. Denna rapport beskriver ett protokoll för mätning av de absoluta nivåerna i plasma miRNA, använder RT-qPCR med eller utan före förstärkning.
En fast volym (200 µL) av EDTA-plasma var beredd från blodet samlas in från femoral ven av medvetna cynomolgusapor (n = 50). Total RNA extraherades med hjälp av kommersiellt tillgängliga system. Plasma MicroRNA kvantifierades genom sonden-baserade RT-qPCR-analyser som innehåller miRNA-specifika framåt/bakåt PCR primer och sond. Standard kurvor för absolut kvantifiering genererades med hjälp av kommersiellt tillgängliga syntetiska RNA oligonukleotider. En syntetisk cel-miR-238 användes som en extern kontroll för normalisering och kvalitet bedömning. De MicroRNA som visade kvantifiering cykel (Cq) värden över 35 var pre förstärkta före steget qPCR.
Bland de 8 MicroRNA undersökt, var miR-122, miR-133a och miR-192 detekterbar utan före förstärkning, medan miR-1, miR-206 och miR-499a krävs före förstärkning på grund av deras låga nivåer. MiR-208a och miR-208b var inte upptäckas även efter före förstärkning. Prov bearbetning effektivitet utvärderades av Cq värdena på de spetsiga cel-miR-238. I denna analys metod, teknisk variation uppskattas vara mindre än 3 gånger och den nedre gränsen för kvantifiering (LLOQ) var 102 kopia/µL, för de flesta av de undersökta microRNA.
Detta protokoll ger en bättre uppskattning av mängden plasma MicroRNA, och kvalitetsbedömning av motsvarande data från olika studier. Med tanke på det låga antalet MicroRNA i kroppsvätskor, före förstärkning är användbart för att förbättra identifiering av dåligt uttryckt microRNA.
Introduction
Ett ökande antal studier har varit att utforska mikroRNA (Mirna) som biomarkörer för diagnos och prognos av cancer, eller övervakning och upptäcka andra sjukdomar i icke-kliniska och kliniska studier1,2,3 . Kvantitativ realtids omvänd Transkription PCR (RT-qPCR) är en av de vanligaste metoderna som används för att bedöma enskilda mål MicroRNA, eftersom denna teknik är mer känslig än microarray4 och RNA-sekvensering baserade plattformar5. I allmänhet mäts miRNA uttryck i förhållande till ett referensprov som använder den ΔCq metod6. Detta tillvägagångssätt är lämpligt för att undersöka fysiologiska förändringar i genen uttryck målnivåer. Relativ kvantifiering av cirkulerande MicroRNA har dock begränsat verktyget på grund av deras små mängder. Dessutom gör teknisk variation det svårt att jämföra resultaten från olika studier, eftersom olika laboratorier anpassa protokollen RTqPCR experimentella annorlunda, vilket leder till inkonsekvent eller även motstridiga resultat från olika studier7.
Med tanke på den oro som nämns ovan, kan absolut kvantifiering vara lämpligare för bedömning av de små kvantiteterna MicroRNA i kroppsvätskor. Den absoluta kvantifiering metoden använder en standardkurva som genereras från kända koncentrationer av syntetiska RNA oligonukleotider som är identiska i sekvens med den motsvarande mål miRNA8. Hälsa och Environmental Sciences Institute (HESI) tekniska utskottet genomik nyligen genomfört omfattande studier för att jämföra resultaten av absoluta mätningar av plasma MicroRNA, över flera provplatser. Resultaten visade att använda ett standardprotokoll för absoluta kvantitering av MicroRNA gett jämförbara resultat över flera test platser9. RT-qPCR-analys metod som beskrivs i den aktuella studien är nästan identisk med den HESI standardprotokoll, som innehåller multiplexade analys av flera miRNA mål, och före förstärkning till stöd detektion av låga uttryck microRNA.
I denna studie en fast volym (200 µL) av EDTA-plasma beredd från blodet samlas in från femoral ven av medvetna cynomolgusapor (n = 50) var används10. Följande protokoll beskriver förfarandet för utarbetande av plasmaprover, utvinning av miRNA och RT-qPCR, inklusive före förstärkning. Viktigare, har ytterligare teknisk information om protokollet inkluderats, så att mängden mål MicroRNA i proverna kan valideras i kombination med en väl kvalificerad process. Standardkurvan för varje miRNA validerades först, för dess enskilda detekteringsområde, före dess kvantifiering i biologiska prover. Kvaliteten på den nuvarande metoden utvärderades andra omfattande genom Cq värden av en yttre kontroll (cel-miR-238). Denna plattform ger därför mer informativ och tillförlitliga uppgifter för att jämföra resultaten från olika studier eller laboratorier.
Profiler av 8 MicroRNA har inkluderats i denna rapport som representativa resultat från metoden analys beskrivs här. Dessa MicroRNA har föreslagits som möjliga säkerhet biomarkörer är associerad med vävnadsskada på levern (miR-122 och miR-192), hjärta (miR-1, miR-208a, miR-208b och miR-499a) och skelettmuskulatur (miR-133a och miR-206) i gnagare och människa3, 11,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår omfattande bedömning föreskrivs en mer rigorös statistisk analys av omfattningen av det dynamiska omfånget, vilket anges tydligt att omfattningen av variationen mellan enskilda prover var extremt olika bland de MicroRNA testade. Även om dessa variationer kan hänföras till deras små mängder i kroppsvätskor, bör det noteras att dessa data som speglar inte bara biologiska variationer, men också tekniska varianter. De flesta av tekniska variationen kan bedömas med hjälp av Cq värdena i externa kontrollen …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning tog inte emot några specifika stipendier från finansiärer inom den offentliga, kommersiella eller icke-vinstdrivande sektorn.
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
References
- Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
- Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
- D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
- Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
- Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?–The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
- Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
- Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
- Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
- Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
- Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
- Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
- Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
- Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
- Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson’s disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
- Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
- Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
- Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
- Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
- Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
- Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
- Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
- Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
- Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
- Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).
