在这里, 我们提出了一个协议的图像人类胰腺切片三维 (3D) 使用优化的被动清除方法。这篇手稿演示了这些程序的被动光清除后, 多免疫荧光染色, 以确定关键元素的自主神经和感觉神经网络支配人类胰岛。
利用传统的组织学方法, 研究人员在大规模3D 的图像整体组织或器官的能力受到阻碍。组织学切片一般限于 < 20 µm 作为福尔马林固定石蜡切片的玻璃幻灯片或 500 µm。此外, 光从组织内的大分子中散射, 特别是脂质, 可以防止成像深度 > 150 µm 与大多数共聚焦显微镜。为了减少光散射和允许使用简单的共焦显微镜进行深层组织成像, 开发了各种光学清除方法, 它们与浸泡法固定的啮齿动物和人体组织样品有关。几种方法与丙烯酰胺和组织清除、十二烷基硫酸钠 (SDS) 的蛋白质交联有关。其他光学清洗技术使用各种溶剂, 虽然每一个修改都有不同的优缺点。本文介绍了一种优化的无源光清除方法, 用于研究人类胰腺的神经支配, 特别是对人类胰岛的神经支配进行审讯。
直到最近, 3 维 (3D) 大组织或整个器官的重建是通过费力的序列切片, 染色, 和图像重建的多个部分。这些方法有几个缺点, 包括依赖于大量的串行部分, 不良的组织渗透与抗体, 和光散射防止深层成像组织内。为了获得更强的光和抗体穿透力, 研究人员开发了化学方法来保存蛋白质抗原, 同时去除大部分的光散射脂。一些相关的方法是明确脂质交换丙烯酰胺-杂交刚性成像组织水凝胶 (透明), 被动透明技术 (协议), 和灌注辅助剂释放原位(部) (在1,2 中查看 ,3,4,5,6。清晰的方法是基于稳定的蛋白质使用甲醛, 丙烯酰胺和双水凝胶, 其次是脂质去除电泳在 SDS 溶液2。此方法后来被修改为被动清除和高级成像7。进一步的优化导致消除的双和不同百分比的甲醛在水凝胶溶液 (1-4%) 获得最佳的抗原稳定与最短的结算时间的技术称为协议8。早期的尝试开发这些光学清除技术涉及的有机或其他化合物, 难以使用和淬火内源性荧光蛋白的转基因小鼠模型。这些额外的方法包括鳞片, 无障碍的脑/体鸡尾酒和计算分析 (立方), 开关和尺寸成像的溶剂清除器官 (迪斯科) 方法, 所有具有各种优缺点9, 10、11、12。原清晰方法是在富含脂质的小鼠脑组织中开发的, 光学清除方法在人体组织中有限度的测试7,8,11,13,14.
光学清除方法是理想的跟踪神经过长的距离, 在完整的鼠标中枢神经系统。胰腺是由自主神经和感觉神经系统支配的。胰腺内分泌室, 胰岛, 包括一个非常小的部分整个器官 (1-2%) 和胰岛已知的大小异质性 (50-250 µm), 内分泌细胞比例, 密度特别是在糖尿病 (审查在15 ,16)。在开发一个协议, 几个光学清除方法被测试为人的胰腺和一个契约做法被发现提供最佳的平衡时间到清楚 (~ 2 星期) 以优秀形态学保存神经和小岛。最后的优化程序在这里描述的神经-岛屿网络的大尺度 (毫米距离) 和高分辨率3D 成像的多个完整的胰岛。该技术适用于人胰腺后立即固定或储存后, 以及标本固定在中性缓冲福尔马林和嵌入石蜡。样品适用于共焦或 lightsheet 显微镜成像。
新的光学清除方法的可用性, 允许对动物模型中的中枢神经系统和周围神经系统进行空前大规模的检查。人类胰腺的总体神经支配模式在很大程度上是由于组织密度和难以获得高质量的 biospecimens。本协议提供了一个优化的组织清除协议的人胰腺组织从固定或石蜡嵌入的档案样本。
清除时间取决于样本大小、固定类型、持续时间、存储持续时间, 可能需要 1-8 周, 因此以下考虑因素是至关重要的。最好是在4% 粉煤灰固定后尽快清除组织, 因为长期贮存会增加清理时间。为了减少清洁时间, 水凝胶单体中的粉煤灰含量从4% 减少到 1%, 用于人类胰腺的固定步骤。对于其他组织, 特别是小鼠组织, 必须根据经验确定提供足够的水凝胶刚性来保存抗原所需的煤灰数量。充分的清除也是必要的, 因为在清除的组织中抗体的渗透率降低, 二级抗体的表面染色增加。每隔一天 (甚至每天) 更改结算解决方案, 最好保持 pH 值恒定和洗涤剂新鲜。反之, 过度清除会对细胞形态产生负面影响, 增加组织碎。由于一些胰腺样本由于固有的病症, 如慢性胰腺炎或其他病症的纤维化区域的不均匀性, 所以经常监测这一过程是很重要的。使用 vibratome 厚剖面也可用于制造均匀厚度, 但不需要。监测清理过程, 因此, 只要光通过样品, 样品就会从洗涤剂中除去, 确保样品被充分清除。
抗体穿透和表面染色是重要的问题, 考虑与条约样本。为了确保良好的抗体渗透, 它的关键是孵化的样品与主抗体至少2天。各种抗体有不同的扩散速率, 并应单独进行优化, 但对于大多数抗体, 4 天是足够的持续时间, 充分渗透在 1 mm3样本。如果表面染色是一个问题, 特别是对 Lightsheet 成像, 样品可以被切成一半, 或表面剥离后染色。小格式的抗体时, 可用的将有助于组织渗透8。Preconjugated 抗体似乎没有工作, 以及相同的游离克隆和更高的背景, 从非特异性结合和较差的组织渗透可以观察, 如果他们的工作在所有。为了提高 preconjugated 抗体的成功率, 在染色缓冲液中增加血清和 TritonX-100 浓度, 并使用更长的孵化 (> 4 天)。染色后, 在轮辋的样品孵化数天是至关重要的。清除组织膨胀的 PBS 和轮辋孵化使他们收缩回原来的大小。特别是 lightsheet 成像, 样品应充分平衡前成像。
当在共焦显微镜上成像样品时, 每次选择新的位置时必须设置校正。不同的采集深度和染色强度的变化在整个组织需要调整的每个区域的组织, 以最佳成像。同样, 必须仔细考虑所使用的二次抗体。光谱分解是具有挑战性的协议样本, 所以荧光必须适当选择低激发或发射重叠, 以确保一个明亮的信号时, 过滤在共焦显微镜的排放。对于每个应用程序, 必须在分辨率、成像速度和降噪之间达成平衡, 以便在不进行光漂白的情况下获得最佳质量的图像。分辨率大于 1024 x 1024 是不可探测的人眼, 但可能是必要的某些应用, 如果量化的污渍是必要的。
在选择光交换技术和选择光学清除方法时, 有很多事情需要考虑。低丰度抗原可能无法被检测使用公约的方法, 因此有限制抗原检测。某些抗原, 如免疫抗原 (CD3, CD4, CD8,等) 被公约方法破坏, 尽管有高质量的抗体可以检测到它们, 但它们是无法察觉的。这种方法的另一个局限性是在清除染色后难以辨别的施主胰腺之间的固有变异性。每个供体组织在手术过程中都趋向于清除和染色, 但不同的供体组织在清除后的清除时间和组织形态学质量有很大差异。使用档案组织的能力可以减轻这种限制, 如果一个人可以有足够的机会获得大量的病人胰腺样本, 虽然这尚未彻底调查。这里所报告的《公约》议定书被认为是廉价的, 而且很容易用标准的实验室设备来实施。清除样品适合通过传统的共焦显微镜成像, 以及2光子和 Lightsheet 技术, 并提供高分辨率3D 图像的神经和胰岛大段的人类胰腺。该程序的未来应用包括研究胎儿胰腺的外分泌和内分泌隔间和胰岛研究1型和2型糖尿病。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢 Dr. 安福和约瑟夫 Canzano 的技术援助, Dr. 詹妮弗 Treweek 的宝贵意见, Dr. 克里斯汀顿和 Dr. 卡尔 Deisseroth 培训通过斯坦福大学的清晰度研讨会。JDRF nPOD 和器官采购组织提供了组织样本。这项工作是由 JDRF (47-2014-1), 太平洋慈善信托基金 (2015-PG-T1D052) 和 NIDDK 1OT2 TR001773 到交通部。
10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibody | |||
CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
Secondary Antibody | |||
Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |